生物大數(shù)據(jù)及人工智能促進(jìn)腫瘤診斷與治療創(chuàng)新
——訪復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院消化內(nèi)科主任劉杰

文圖/《中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)》 費(fèi)菲

生物大數(shù)據(jù)和人工智能的時(shí)代已經(jīng)到來(lái)。人工智能在生物大數(shù)據(jù)領(lǐng)域的參與度不斷提升，促進(jìn)了醫(yī)療健康的進(jìn)步和發(fā)展。相比人腦，人工智能的優(yōu)越性在于可更高效地處理海量數(shù)據(jù)，迅速找到一些特征和規(guī)律；還可以利用龐大的醫(yī)學(xué)知識(shí)庫(kù)和數(shù)據(jù)庫(kù)，建立醫(yī)生臨床輔助決策系統(tǒng)，幫助醫(yī)生進(jìn)行疾病診斷和治療。

在從事消化系統(tǒng)疾病的臨床診療和研究工作30余年后，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院消化內(nèi)科主任兼復(fù)旦大學(xué)消化疾病研究所所長(zhǎng)、復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院雙聘PI 劉杰教授近幾年感受最深的是，他的研究工作已經(jīng)與生物大數(shù)據(jù)和人工智能技術(shù)密不可分，為臨床診療帶來(lái)更多新的策略：基于最新的科研進(jìn)展建立惡性腫瘤診療的系列新方法，包括液體活檢腫瘤無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)，用于腫瘤的診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)控；通過(guò)人工智能技術(shù)結(jié)合PDX 模型等設(shè)計(jì)腫瘤精準(zhǔn)治療方案；建立第四代針對(duì)實(shí)體瘤的分泌型CART 技術(shù)，為實(shí)體瘤免疫治療提供手段；開(kāi)展了基于人工智能的腫瘤個(gè)體化新抗原疫苗研究，通過(guò)人工智能深度學(xué)習(xí)算法挖掘新抗原信息，合成特異的新抗原，制成疫苗可注射到對(duì)應(yīng)患者體內(nèi)，刺激其體內(nèi)特異的針對(duì)新抗原的免疫反應(yīng)。日前，劉杰教授從生物大數(shù)據(jù)及人工智能在腫瘤診療應(yīng)用的角度，介紹了相關(guān)研究結(jié)果。

制定防治策略應(yīng)從癌癥本質(zhì)出發(fā)

2018 年9 月12 日，Bray F, Ferlay J 等在CA：腫瘤臨床醫(yī)師雜志（CA：Cancer J Clin）發(fā)表了一篇最新的全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告，主要分析了2018年各種癌癥的發(fā)病率和致死率。這項(xiàng)研究通過(guò)對(duì)185 個(gè)國(guó)家的研究，著重分析了全球腫瘤發(fā)病和致死的地理性差異。研究估計(jì)，2018 年全球范圍內(nèi)將有1810 萬(wàn)癌癥新發(fā)病例和960 萬(wàn)癌癥死亡病例。全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率排名前10 位的癌癥數(shù)據(jù)顯示，肺癌是最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型（占所有癌癥的11.6%），也是癌癥死亡的主要原因（占癌癥總死亡率的18.4%）。女性乳腺癌（11.6%）、結(jié)直腸癌（10.2%）、前列腺癌（7.1%）的發(fā)病率最高；結(jié)直腸癌（9.2%）、胃癌（8.2%）和肝癌（8.2%）死亡率最高。

該雜志在2015 年報(bào)道的全球2012 年并結(jié)合中國(guó)2011 年數(shù)據(jù)顯示，世界每年新發(fā)病例數(shù)為1400 萬(wàn)，死亡病例數(shù)為800 萬(wàn)。2012 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，每年癌癥新發(fā)病例約1400 萬(wàn)，死亡約800 萬(wàn)，女性發(fā)病率最高的癌癥為乳腺癌，男性最高發(fā)的癌癥為肺癌。我國(guó)每年新發(fā)病例337 萬(wàn)例，肺癌、女性乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、食管癌、宮頸癌、子宮腫瘤、胰腺癌、卵巢癌等約占75%，死亡211 萬(wàn)例；肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、女性乳腺癌、胰腺癌、腦瘤、宮頸癌、白血病等占84%。短短五六年間，癌癥的發(fā)病率和死亡率都出現(xiàn)了大幅攀升。

□劉杰：癌癥發(fā)生的根本原因是免疫失衡

癌癥的根源在哪里？劉杰教授介紹，2017 年11月CA：Cancer J Clin雜志報(bào)道，77%的癌癥根源在于不良生活方式，而遺傳因素和環(huán)境因素只占到24%和9%。生活方式導(dǎo)致癌癥的主要危險(xiǎn)因素主要包括以下幾個(gè)方面：一是吸煙，19.0%的癌癥發(fā)病和29%的癌癥死亡與吸煙有關(guān)；二是肥胖，7.8%的癌癥發(fā)病和6.5%的癌癥死亡與肥胖有關(guān)；三是飲酒，5.6%的癌癥發(fā)病和4%的癌癥死亡與飲酒有關(guān)；四是紫外線(xiàn)輻射，4.7%的癌癥發(fā)病和1.5%的癌癥死亡與紫外線(xiàn)輻射有關(guān)；五是缺乏鍛煉，2.9%的癌癥發(fā)病和2.2%的癌癥死亡與缺乏鍛煉有關(guān)；六是缺乏水果蔬菜，1.9%的癌癥發(fā)病與缺乏水果蔬菜有關(guān)；七是缺乏膳食纖維；0.9%的癌癥發(fā)病與缺乏膳食纖維有關(guān)；八是缺鈣，0.4%的癌癥發(fā)病與缺鈣有關(guān)。

劉杰教授近幾年出門(mén)診時(shí)經(jīng)常接診由不良生活方式導(dǎo)致癌癥的20 多歲年輕患者。舉兩個(gè)例子，病例一：21 歲女性患者為胃竇低分化印戒細(xì)胞癌伴巨大潰瘍，問(wèn)病史得知其家庭條件優(yōu)裕，從十幾歲開(kāi)始，大量攝入方便面、各種膨化食品，每天不喝白開(kāi)水，只喝飲料。病例二：男性，28 歲，某財(cái)富公司HR。4 天前出現(xiàn)全身乏力，胃納減少，易飽腹，無(wú)腹痛，排便異常。到院就診，實(shí)驗(yàn)室檢查顯示，中度貧血，輕度肝酶異常，無(wú)黃疸。腫瘤標(biāo)志物水平：血清中癌胚抗原（CEA）升高（＞1000μg/L），CA199 水平升高（706.3 U/mL）。結(jié)腸鏡檢查提示，橫結(jié)腸癌伴腸腔狹窄。病理提示，（橫結(jié)腸）粘液腺癌（判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)CEA 水平＞5μg/L，CA199 水平＞37 U/mL，CA724 水平＞6.9 U/mL 時(shí)檢測(cè)視為陽(yáng)性）。PET/CT 提示，橫結(jié)腸局部腸壁明顯增厚并FDG 攝取增高（SUVmax=10.5）。根據(jù)檢查結(jié)果考慮為惡性腫瘤伴周?chē)?rùn)，結(jié)腸癌可能大。肝彌漫性轉(zhuǎn)移（SUVmax=6.7）、腹膜廣泛種植轉(zhuǎn)移（SUVmax=1.9）、全身多發(fā)骨轉(zhuǎn)移（SUVmax=6.7）可能大；腹盆腔積液。初步診斷為橫結(jié)腸粘液腺癌伴肝、腹壁、骨多發(fā)轉(zhuǎn)移。

在問(wèn)病史時(shí)發(fā)現(xiàn)，這名年輕腫瘤患者工作強(qiáng)度高，從早上9 點(diǎn)到晚上9 點(diǎn)，每天工作時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12 小時(shí)以上，而且多數(shù)時(shí)間是在與客戶(hù)通話(huà)，工作生活習(xí)慣不利于健康。劉杰教授建議，保持健康應(yīng)該經(jīng)常到戶(hù)外活動(dòng)，多進(jìn)行日光照射。日光照射比攝入維生素D 加鈣對(duì)健康更有益。人們長(zhǎng)久地坐著使用電腦工作，缺乏陽(yáng)光照射和維生素D、鈣、磷，將對(duì)免疫系統(tǒng)造成不良的影響。他總結(jié)了可提升免疫力的7 項(xiàng)腫瘤綜合防治策略：一是堅(jiān)持適量運(yùn)動(dòng)，多站少坐，每天出點(diǎn)汗；二是保持身心放松，控制壞情緒，每天大笑10次以上；三是保持良好睡眠，必要時(shí)用藥物促進(jìn)睡眠；四是少食高熱量油炸食物，少食腌制食品；五是常吃水果、豆?jié){、堅(jiān)果、靈芝孢子粉、綠茶；六、常補(bǔ)充纖維素，以食物補(bǔ)充為主；七是補(bǔ)充維生素D 和鈣，以陽(yáng)光照射為主。同時(shí)指出運(yùn)動(dòng)不能過(guò)量，如過(guò)量也會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。

他提示說(shuō)，癌癥發(fā)生的根本原因是免疫失衡，可以說(shuō)，癌癥是基因突變與免疫的博弈。正常DNA 由于紫外線(xiàn)和各種輻射、化學(xué)誘變劑、病毒等因素導(dǎo)致基因突變（腫瘤驅(qū)動(dòng)基因），免疫監(jiān)視（DNA 修復(fù)，抑癌基因誘導(dǎo)凋亡），這一過(guò)程失敗才會(huì)導(dǎo)致癌癥。每個(gè)人身上都有癌細(xì)胞，突變細(xì)胞是否形成癌，取決于是否處于免疫平衡，它一旦突破這個(gè)底線(xiàn)就會(huì)膨脹性生長(zhǎng)。癌細(xì)胞生長(zhǎng)非?？?，最后患者很快去世是免疫系統(tǒng)崩潰而導(dǎo)致的。還有一個(gè)普遍的疑問(wèn)是，肺結(jié)節(jié)是否有必要切除，該怎么對(duì)肺結(jié)節(jié)進(jìn)行觀察？劉杰教授認(rèn)為除了早期切除病變組織的手段，也需要免疫系統(tǒng)與癌細(xì)胞的博弈來(lái)起作用。70%的肺結(jié)節(jié)由免疫系統(tǒng)清除癌細(xì)胞后避免了癌變，僅20%～30%的肺結(jié)節(jié)會(huì)癌變，所以免疫系統(tǒng)在其中起到相當(dāng)關(guān)鍵的作用。

這名年輕患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就已是癌癥晚期，而此前缺乏明顯癥狀，患者家屬表示不解。劉杰教授表示，其實(shí)這種疑問(wèn)很有普遍性，如今不少人在國(guó)內(nèi)定期體檢，還專(zhuān)門(mén)到美國(guó)、歐洲、日本等國(guó)體檢，但常會(huì)出現(xiàn)發(fā)現(xiàn)癌癥時(shí)已是晚期的情況。癌癥的發(fā)展階段主要分為以下幾個(gè)階段：分子癌變階段（8 ～10 年）、細(xì)胞癌變階段（3 ～5 年）、早癌（1 ～3 年）、中晚期癌。目前癌癥檢查基本上是靠超聲、CT、MRI、PET-CT 等儀器，或是AFP、CEA、PSA 等腫瘤標(biāo)志物。黃豆大的腫瘤組織里的癌細(xì)胞數(shù)量都以?xún)|個(gè)計(jì)，所以一旦影像學(xué)發(fā)現(xiàn)腫瘤，已經(jīng)很難說(shuō)是早期癌癥。那么，怎樣才能早期發(fā)現(xiàn)癌癥？劉杰教授團(tuán)隊(duì)近年開(kāi)展的工作之一是基于生物大數(shù)據(jù)及人工智能的診斷和治療，同時(shí)開(kāi)展一些其他研究工作，還有一個(gè)團(tuán)隊(duì)開(kāi)展基于人工智能大數(shù)據(jù)開(kāi)展臨床轉(zhuǎn)化相關(guān)的工作。近幾年他們對(duì)癌癥的診斷方面主要圍繞著基因突變這一領(lǐng)域，治療以免疫治療為主，應(yīng)用幾個(gè)最新的技術(shù)探索出了免疫治療的一些方法。具體而言，在癌癥診斷方面，基于生物大數(shù)據(jù)及人工智能作出決策主要圍繞兩個(gè)技術(shù)：一是疑難病智能診斷平臺(tái)，二是液體活檢早期診斷技術(shù)。

基于大數(shù)據(jù)的疑難病智能診斷平臺(tái)

劉杰教授首先介紹了基于大數(shù)據(jù)的疑難病智能診斷平臺(tái)的建立及應(yīng)用。他說(shuō)，上海復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳與發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心王毅博士創(chuàng)建的“小王醫(yī)生”（www.drwang.top）疑難病智能診斷平臺(tái)，就是一個(gè)基于大數(shù)據(jù)的診斷工具。王毅博士近幾年不斷研發(fā)出一些新的技術(shù)，其中“小王醫(yī)生”可幫助醫(yī)生進(jìn)行疾病輔助診斷，而“小易醫(yī)生”則針對(duì)老百姓問(wèn)診。

在“小易醫(yī)生”上，患者可以問(wèn)診并獲得診斷，得到很有用的信息提示，比如，對(duì)應(yīng)癥狀的是什么疾病，頭痛、發(fā)燒、咳嗽的診斷治療可全部列出。如果能提供全基因組數(shù)據(jù)，診斷率基本能達(dá)到95% ～ 100%，對(duì)疑難雜癥的診斷也很有參考價(jià)值。

“小王醫(yī)生”（www.drwang.top）是一個(gè)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)支持系統(tǒng)，通過(guò)測(cè)評(píng)后發(fā)現(xiàn)，“小王醫(yī)生”在人類(lèi)疾病的基因診斷方向上達(dá)到全球領(lǐng)先水平。它基于1200 萬(wàn)篇PubMed 文獻(xiàn)摘要和文本挖掘算法，可以提供對(duì)疾病的輔助診斷。兩分鐘內(nèi)可以提取60 萬(wàn)的文獻(xiàn)量，相當(dāng)于醫(yī)生在會(huì)診疑難病時(shí)，旁邊有個(gè)智能大腦，將癥狀一輸入（如果結(jié)合二代基因組數(shù)據(jù)診斷更精準(zhǔn)），就能尋找疾病相關(guān)的表型，根據(jù)臨床表型列出10 項(xiàng)可能疾病的列表，包括尋找疾病相關(guān)的基因和遺傳突變，尋找疾病相關(guān)的藥物，以及尋找疾病相關(guān)的專(zhuān)家名單等信息。

臨床上常會(huì)遇到不明原因的腫瘤找不到原發(fā)灶的困惑。比如，劉杰教授接診的一名北京患者全身查體，包括CT、胃腸鏡等都查不到原發(fā)灶；還有杭州患者腹股溝兩串淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，卻找不著原發(fā)灶。通過(guò)疑難病智能診斷平臺(tái)這項(xiàng)技術(shù)可以為診斷提供方向。目前利用“小王醫(yī)生”和全基因組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)輔助診斷了30 例罕見(jiàn)病，找到了遺傳突變。

以一名患者的診斷為例：深圳男性患兒，10 歲。在北京體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)肝纖維化伴有輕度脂肪肝，后經(jīng)華山醫(yī)院肝臟病理證實(shí)。無(wú)肝病病史，父母健康。肝功化驗(yàn)等檢查無(wú)明顯異常。先天性肝纖維化（CHF）伴有多囊肝及多囊腎的PKHD1，考慮為突變的Caroli?。ㄏ忍煨愿蝺?nèi)膽管擴(kuò)張癥）。把孩子的癥狀等代入這個(gè)系統(tǒng)，提示他是患上了希特林缺乏癥（Citrin Deficiency）。那么，什么是希特林缺乏癥？Citrin 是線(xiàn)粒體內(nèi)鈣結(jié)合天冬氨酸/谷氨酸載體蛋白，編碼基因?yàn)镾LC25A13?；純簩?duì)糖代謝存在障礙，不能吃米飯饅頭，他父母不了解這個(gè)情況，給他吃了這些食物，孩子肝臟不能代謝導(dǎo)致肝纖維化。

液體活檢技術(shù)應(yīng)用于腫瘤早期篩查

近年來(lái)，液體活檢早期診斷技術(shù)在全球引發(fā)較大關(guān)注，國(guó)際上最頂尖的學(xué)術(shù)期刊《自然》（Nature）、《科學(xué)》（Science）、新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志（NEJM）、《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》（PANS）相繼發(fā)表相關(guān)論文，《麻省理工大學(xué)科技評(píng)論》將該技術(shù)評(píng)選為“2015 年十大突破技術(shù)”，并入選美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO） 2015 年腫瘤年度進(jìn)展報(bào)告10 年前瞻。

這項(xiàng)基于表觀遺傳學(xué)的液體活檢新技術(shù)研究的主要原理是，利用高效的全基因組5hmC（5-羥甲基胞嘧啶）檢測(cè)方法，檢測(cè)胃腸癌及癌旁組織、胃腸癌及健康個(gè)體血漿。通過(guò)分析血漿cfDNA 中全基因組腫瘤特異性5hmC，將之作為腫瘤早期特異性診斷指標(biāo)，以此反映疾病的狀態(tài)，較傳統(tǒng)的ctDNA 檢測(cè)具有更高的特異性與敏感性。通過(guò)診斷可分別得出胃腸良性病、胃腸癌、非胃腸腫瘤與健康個(gè)體的結(jié)論?！爸虚g體”5hmC 不僅標(biāo)志著主動(dòng)去甲基化，也是一個(gè)具有表觀遺傳作用的相對(duì)穩(wěn)定的DNA 標(biāo)記?；谘h(huán)游離cfDNA 5mC 和5hmC 的液體活檢可能更有價(jià)值，因?yàn)槠淠苡绊懟虮磉_(dá)的變化。

基于表觀遺傳學(xué)在腫瘤早期篩查方面的特性，5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）高通量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)明，為解決這一問(wèn)題帶來(lái)了新的可能。目前，5hmC 已被認(rèn)為是極具前景的表觀遺傳學(xué)腫瘤標(biāo)志物?！蹲匀痪C述-遺傳學(xué)》（Nature Reviews Genetics ）雜志2011 年報(bào)道，5hmC 是基因轉(zhuǎn)錄激活的特征之一。在DNA 主動(dòng)去甲基化過(guò)程中，5hmC 作為一個(gè)中間體，是由TET 酶介導(dǎo)的5mC 的氧化產(chǎn)物蛋白。5hmC 主要在全能性基因的外顯子內(nèi)部和靠近轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近富集，且該位點(diǎn)常伴有H3K4me3，因此5hmC 可看作轉(zhuǎn)錄激活的特征之一?！栋┘?xì)胞》（Cancer Cell）、Trends Genet、Epigenomics 等雜志的多篇文獻(xiàn)報(bào)道，5hmC 表達(dá)水平與腫瘤具有相關(guān)性。羥甲基化與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病有關(guān)，且羥甲基化被報(bào)道在腫瘤組織中低表達(dá)。

2011 年《自然-生物技術(shù)》雜志（Nature biotechnol）報(bào)道了5hmC 檢測(cè)技術(shù)——hmC-Seal。2016 年《細(xì)胞》雜志子刊《分子細(xì)胞》（Molecular Cell）報(bào)道了低輸入量DNA 的5hmC 測(cè)序技術(shù)——Nano-hmC-Seal。優(yōu)化技術(shù)Nano-hmC-Seal 可穩(wěn)定重現(xiàn)不同DNA 輸入量的結(jié)果，可適用DNA 總量范圍：1ng ～100μg，在不同樣本類(lèi)型中均可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的可能，滿(mǎn)足液體活檢低量cfDNA的檢測(cè)要求。

人腫瘤血中存在循環(huán)游離cfDNA 5hmC 生物標(biāo)志物，不同來(lái)源的腫瘤（如肺、結(jié)腸、胃、肝、卵巢、胰腺）會(huì)釋放不同的5hmC 修飾的cfDNA,而cfDNA 5hmC的檢測(cè)技術(shù)能實(shí)現(xiàn)低至1ng DNA 的檢測(cè)。低輸入量DNA 的5hmC 測(cè) 序 技 術(shù)——Nano-hmC-Seal，只 需1ng DNA 即可進(jìn)行表觀測(cè)序，說(shuō)明這一測(cè)序方法十分敏感，具有臨床推廣價(jià)值。劉杰團(tuán)隊(duì)隨后用小鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證也獲得了成功，當(dāng)時(shí)提取的小鼠血量很少，卻能夠支持液體活檢技術(shù)（表觀測(cè)序技術(shù)），這就為臨床推廣這項(xiàng)技術(shù)帶來(lái)了很大的便利。這是因?yàn)?，如果醫(yī)生要求患者進(jìn)行表觀測(cè)序需要抽20 毫升血，患者必會(huì)有所抗拒，而只需抽1mL 血就能進(jìn)行表觀測(cè)序，患者應(yīng)該愿意配合。

研究共納入90 例健康人群，260 例腫瘤患者（包括80 例結(jié)直腸癌、71 例胃癌、25 例肝癌、34 例胰腺癌、46 例甲狀腺癌等），71 例胃腸良性病患者。研究者對(duì)5hmC 修飾在血漿cfDNA 和組織全基因組DNA 中均進(jìn)行了檢測(cè)。由于cfDNA 不單單是腫瘤釋放的，更多是由免疫系統(tǒng)釋放的，因此，研究監(jiān)測(cè)目標(biāo)是機(jī)體的整體免疫狀況，同時(shí)對(duì)肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤均制定了診斷標(biāo)準(zhǔn)。

劉杰教授發(fā)現(xiàn)，差異性的5hmC 位點(diǎn)是與腫瘤來(lái)源顯著相關(guān)的。循環(huán)游離cfDNA 5hmC 表達(dá)譜與腫瘤組織及血細(xì)胞中全基因組DNA 5hmC 表達(dá)譜不全相同，其與DNA 不同的組織細(xì)胞來(lái)源有很大關(guān)系。差異性5hmC 在cfDNA 上的分布廣泛且特異。腫瘤中基因表達(dá)的差異與5hmC 水平的差異密切相關(guān)，這就提示5hmC 對(duì)基因具有調(diào)控功能。他的研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開(kāi)展來(lái)源的相似性度量分析后發(fā)現(xiàn)，健康人與腸癌患者游離cfDNA 的差異性5hmC 分布在組蛋白修飾區(qū)與基因體區(qū)。以癌基因SULF1（sulfatase1） Gene 為例，健康人群和結(jié)腸癌患者血漿中存在明顯差異5hmC 位點(diǎn)。

循環(huán)游離cfDNA 5hmC 可作為腸癌的有效診斷標(biāo)志物（從discovery batch 中檢測(cè)出989 個(gè)差異性5hmC位點(diǎn)）。來(lái)源于血漿中的游離cfDNA 5hmC 能夠明顯區(qū)分結(jié)直腸癌癥患者和健康人群。在discovery batch 和validation batch 兩組中，cfDNA 基因體的5hmC 改變具有更大的相關(guān)性，提示基因體的5hmC 位點(diǎn)可作為更穩(wěn)定的腫瘤標(biāo)志物。研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌、胃癌診斷率達(dá)到90%以上，于是他們進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。其后的初步研究結(jié)果顯示，差異性cfDNA 5hmC 在結(jié)直腸癌診斷中的靈敏度、特異度可達(dá)80%～90%，能夠?qū)崿F(xiàn)結(jié)直腸癌的早期診斷；具有組織特異性，在胃癌、肝癌、胰腺癌、甲狀腺癌的預(yù)測(cè)概率均下降。

循環(huán)游離cfDNA 5hmC 也可作為胃癌的有效診斷標(biāo)志物（從discovery batch 中檢測(cè)出1431 個(gè)差異性5hmC位點(diǎn)）。來(lái)源于血漿中的游離cfDNA 5hmC 能明顯區(qū)分胃癌患者和健康人群。其后的初步研究結(jié)果也顯示，差異性cfDNA 5hmC 在胃癌診斷中的靈敏度、特異度可達(dá)90%，能實(shí)現(xiàn)胃癌的早期診斷；具有組織特異性，在結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、甲狀腺癌的預(yù)測(cè)概率均下降。

為了驗(yàn)證腫瘤患者血漿中cfDNA 的5hmC 腫瘤相關(guān)性，劉杰團(tuán)隊(duì)利用PDX 模型驗(yàn)證其來(lái)源。利用5hmC 技術(shù)捕獲PDX 模型血漿中人源的cfDNA 序列，胃癌、腸癌PDX 血漿中人源的cfDNA 序列比例明顯比對(duì)照小鼠多。PDX 血漿中cfDNA 與供體腫瘤基因組DNA 二者的5hmC 表達(dá)譜之間的相關(guān)性與PDX 模型傳代次數(shù)相關(guān)，傳代次數(shù)越多，移植瘤越穩(wěn)定。PDX模型中的血漿cfDNA 5hmC 與供體腫瘤DNA 5hmC 來(lái)源一致，患者血漿cfDNA 5hmC 表達(dá)水平與PDX 模型cfDNA 表達(dá)水平一致。

在未來(lái)，臨床醫(yī)生有望通過(guò)液體活檢對(duì)疾病進(jìn)行診斷和治療，ctDNA 液體活檢將替代侵入組織活檢（比如肝穿刺、腎穿刺、肺穿刺），成為腫瘤診斷領(lǐng)域突破性的新技術(shù)。同時(shí)，液體活檢對(duì)治療也有幫助，比如肺癌EGFA 檢測(cè)就可以給藥，還可以進(jìn)行靶向藥治療；但從另一方面來(lái)說(shuō)，液體活檢對(duì)診斷的價(jià)值還需要進(jìn)一步提高，因?yàn)槟[瘤不是單基因疾病，而是多基因疾病。

由于缺乏用于早期診斷的靈敏特異的生物標(biāo)志物，臨床上常會(huì)出現(xiàn)肝癌患者在癌癥早期無(wú)明顯癥狀，甚至患病后較長(zhǎng)時(shí)間毫無(wú)知覺(jué)，從而導(dǎo)致常常錯(cuò)過(guò)最佳治療期，一般就診時(shí)已到中晚期，甚至已向肺部等處轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后差。目前運(yùn)用傳統(tǒng)檢測(cè)方法，如甲胎蛋白（AFP），在肝癌早期診斷中的價(jià)值十分有限，有40%的早期肝癌患者無(wú)法被檢測(cè)出，成為影響我國(guó)肝癌死亡率的重要因素。因此，尋找新型的、高效的肝癌早期篩查方式顯得尤為重要。

目前全球主流的DNA 測(cè)序都是分析特定DNA片段的堿基序列ATCG，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥(niǎo)嘌呤的（G）排列方式。劉杰教授團(tuán)隊(duì)則進(jìn)行了DNA 鏈上的開(kāi)關(guān)功能測(cè)序，稱(chēng)為DNA 胞嘧啶（cytosine）表觀遺傳修飾。他認(rèn)為，人體衰老及很多疾病尤其是免疫疾病的發(fā)生與基因開(kāi)關(guān)有關(guān)，即病根在于調(diào)控開(kāi)關(guān)不能打開(kāi)，因此表觀基因測(cè)序5hmC（5-羥甲基胞嘧啶）的測(cè)序技術(shù)非常關(guān)鍵。

“如果臨床醫(yī)生把自己研究領(lǐng)域與新的技術(shù)進(jìn)行交叉，對(duì)臨床診療能帶來(lái)很大的提高。”劉杰教授說(shuō)。多年來(lái)他始終注重開(kāi)展學(xué)科交叉研究，由此在國(guó)內(nèi)較早開(kāi)展了全基因組5hmC 測(cè)序。他曾與一位知名化學(xué)家合作開(kāi)展學(xué)科交叉研究，共同開(kāi)展973 課題，還積極開(kāi)展了與物理學(xué)、材料學(xué)、人工智能的學(xué)科交叉研究。

6 年前，劉杰教授就與芝加哥大學(xué)開(kāi)發(fā)DNA 修飾堿基5hmC 的檢測(cè)和測(cè)序的化學(xué)家何川教授合作，研究如何進(jìn)行5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）高通量檢測(cè)技術(shù)技術(shù)轉(zhuǎn)化。他們當(dāng)時(shí)設(shè)計(jì)的項(xiàng)目是基于大數(shù)據(jù)的診斷結(jié)合人工智能技術(shù)。通過(guò)在臨床收集近4000 例樣本，經(jīng)機(jī)器學(xué)習(xí)和大數(shù)據(jù)分析，利用肝癌樣品和健康良性樣品的差異基因建立5hmC 肝癌診斷模型。近期得出的研究結(jié)論是：5hmC 高通量檢測(cè)技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于它能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控癌癥的狀態(tài)，及時(shí)反映受檢者是否罹患癌癥，是一個(gè)真正具有實(shí)際意義的癌癥早篩技術(shù)，可大幅提高肝細(xì)胞癌癥檢測(cè)的準(zhǔn)確率（靈敏度達(dá)90%、特異性可達(dá)94%），相信應(yīng)用于臨床不僅能提高肝癌的早期診斷率，還能及時(shí)監(jiān)測(cè)肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

劉杰教授指出，在腫瘤治療中，現(xiàn)在人們都盯著腫瘤這個(gè)“小偷”去開(kāi)展研究，但小偷是各種各樣經(jīng)常變化的（腫瘤突變異質(zhì)性和突變動(dòng)態(tài)演化），而且老盯著腫瘤去治療，比如化療，而忽視了對(duì)免疫系統(tǒng)的重要性是得不償失的。就像靶向治療，今天靶向治療了一個(gè)小偷，明天后天又出來(lái)其他的小偷，是抓不完的，所以不如把自身免疫防線(xiàn)建設(shè)得很強(qiáng)大。他們目前的研究工作集中在腫瘤診斷研究方面，怎么從患者的免疫系統(tǒng)的狀況來(lái)判定，免疫系統(tǒng)狀況到哪一步患者可能要發(fā)生腫瘤了。劉杰教授同時(shí)提示，應(yīng)重視生活習(xí)慣對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，他最近接診的3 名腫瘤患者都是62 歲，剛退休不久，這可能是人們改變生活習(xí)慣時(shí)會(huì)給免疫系統(tǒng)帶來(lái)非常大的影響。目前該項(xiàng)技術(shù)在芝加哥大學(xué)、北京大學(xué)合成與功能生物分子中心、華山醫(yī)院復(fù)旦大學(xué)消化疾病研究所、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院、原第二軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院東方肝膽外科醫(yī)院等多家醫(yī)院、研究機(jī)構(gòu)正在進(jìn)行多項(xiàng)研究合作。

人工智能精準(zhǔn)治療方案給腫瘤“個(gè)體化打擊”

在腫瘤治療方面，劉杰教授主要從他們團(tuán)隊(duì)三個(gè)方面的工作進(jìn)行了介紹。一是精準(zhǔn)方案選擇——協(xié)同抗癌藥物組合的高效篩選系統(tǒng)（RACS）；二是腫瘤免疫治療（第四代分泌型CAR-T）；三是腫瘤新抗原疫苗（Neoantigen）。

第一，如何選擇癌癥精準(zhǔn)治療方案？可應(yīng)用協(xié)同抗癌藥物組合的高效篩選系統(tǒng)（RACS）。

劉杰教授團(tuán)隊(duì)和同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院曹志偉教授合作開(kāi)發(fā)基于藥靶網(wǎng)絡(luò)和組學(xué)數(shù)據(jù)的協(xié)同抗癌藥物組合的高效篩選系統(tǒng)（RACS）。這套人源性腫瘤移植動(dòng)物模型（PDX）建立及方案篩選，將國(guó)際上的協(xié)同用藥預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率從 61%提升到了78% （隨機(jī)預(yù)測(cè)為 50%）。協(xié)同用藥預(yù)測(cè)排序與標(biāo)準(zhǔn)排序的吻合度達(dá)0.78，該研究已申請(qǐng)了專(zhuān)利。

胃癌、腸癌、肝癌等各種癌癥有差異，不同的肝癌患者也有差異，劉杰團(tuán)隊(duì)為每個(gè)患者個(gè)性化建成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，設(shè)計(jì)一個(gè)非常精準(zhǔn)合理的給藥方案，包括以哪些藥物是阻斷藥，哪些藥物起協(xié)同作用，這些藥物怎么去阻斷腫瘤又不影響免疫系統(tǒng)。任何藥物理論上都可以篩選，比如針對(duì)胃癌可以篩選100 種藥物。 通過(guò)研究現(xiàn)有的抗癌藥物組合的靶點(diǎn)和癌癥基因表達(dá)譜特征，采用機(jī)器學(xué)習(xí)算法，提取出具有協(xié)同作用的抗癌藥物組合的網(wǎng)絡(luò)靶向特征，并將其用于潛在協(xié)同藥物組合的排序篩選。RACS 系統(tǒng)先后在B-細(xì)胞淋巴癌、乳腺癌和肺癌細(xì)胞系上分別進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并利用斑馬魚(yú)腫瘤模型，驗(yàn)證出一組具有強(qiáng)協(xié)同作用且低毒的抗乳腺癌協(xié)同藥物組合。

劉杰教授表示，RACS 是一個(gè)大規(guī)模的人工智能篩選系統(tǒng)，各種癌癥都可以通過(guò)RACS 系統(tǒng)上篩選出上市藥物。當(dāng)輸入患者的資料 ，就能提供一個(gè)用藥指導(dǎo)方案，臨床驗(yàn)證效果非常好，他們團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)一步完善這一系統(tǒng)。

第二，腫瘤免疫治療——第四代分泌型CAR-T。

腫瘤治療領(lǐng)域突破性進(jìn)展主要體現(xiàn)在免疫治療領(lǐng)域，腫瘤免疫治療被《科學(xué)》（Science）評(píng)為2013 年“年度突破”之首。這種觀點(diǎn)認(rèn)為，機(jī)體免疫系統(tǒng)是抗腫瘤的前沿與核心，是當(dāng)下腫瘤治療領(lǐng)域最具前景的發(fā)展方向之一。

2018 年，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（PD-1/PDL1 抗體）摘得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的桂冠，而免疫治療的另一支主力——CAR-T 也迎來(lái)了多次重要發(fā)現(xiàn)與突破。CAR-T 抗擊腫瘤的原理是給患者自身的免疫細(xì)胞T細(xì)胞加入一段外源基因，通過(guò)基因改造使其表面表達(dá)CAR 受體，CAR 受體上可以裝上針對(duì)不同配體的“雷達(dá)”，從而使患者自身的免疫細(xì)胞能夠識(shí)別不同的腫瘤，并將其消滅。其原理是經(jīng)嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞能特異性識(shí)別靶抗原，并能脫離主要組織相容性復(fù)合體的限制，單獨(dú)執(zhí)行殺傷靶細(xì)胞的功能。

《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（NEJM）在2013 年以及Annual review 雜志在2014 年報(bào)道，針對(duì)CD19 抗原的CAR-T 細(xì)胞對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病的完全緩解率超過(guò)90%。實(shí)際上，目前CAR-T 免疫治療大多都是針對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤，那么對(duì)實(shí)體瘤怎么治療呢？腫瘤細(xì)胞可通過(guò)PD-1 等免疫檢查點(diǎn)抑制T 細(xì)胞殺傷功能；阻斷該分子就能激活T 細(xì)胞。已有靶向PD-1 和CTLA-4的四種抗體藥物獲批上市，治療非小細(xì)胞肺癌、惡性黑色素瘤等。目前全球登記臨床試驗(yàn)已達(dá)到237 項(xiàng)（Clinicaltrials.gov）。比 如，KEYNOTE-001 研 究 針 對(duì)PD-1 單抗，治療非小細(xì)胞肺癌495 例，PD-L1 ＜50%，ORR 19.4%，PFS 3.7 個(gè) 月。NCT01295827 研 究 針 對(duì)PD-1 單抗，治療晚期惡性黑色素瘤173 例，ORR 26%。

嵌合抗原受體修飾的T 細(xì)胞（CAR-T）根據(jù)不同的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可分為：第一代CAR-T：僅包含CD3-zeta；第二代CAR-T：包括CD3-zeta 和一種共刺激分子結(jié)構(gòu)域；第三代CAR-T：包含CD3-zeta和兩種共刺激分子結(jié)構(gòu)域，因?yàn)門(mén) 細(xì)胞活化需要兩個(gè)信號(hào)。綜合2010 至2014 年Molecular therapy 雜志等文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，CAR-T 治療實(shí)體瘤效果不佳的原因主要有：一是生物屏障，經(jīng)靜脈回輸?shù)腃AR-T 細(xì)胞要發(fā)揮治療作用，必須通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)，趨向到腫瘤部位，只有少量CAR-T 細(xì)胞能最終靶向腫瘤部位并接觸到抗原豐富的腫瘤組織；二是免疫抑制微環(huán)境，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子，如IL-10 可以通過(guò)直接或間接的方式抑制T 細(xì)胞的功能?；蛐揎椡緩揭阅孓D(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)易造成基因組突變，持續(xù)表達(dá)易造成嚴(yán)重副作用。

在過(guò)去的幾年里，CAR-T 細(xì)胞療法與雙特異性抗體療法使T 細(xì)胞能有效地靶向CD19 等抗原，使罹患B 細(xì)胞惡性癌癥的患者得到了極好的緩解，也為腫瘤免疫療法領(lǐng)域帶來(lái)了革新。2011 年至2013 年Expert Opin Biol Ther 等雜志發(fā)表的文獻(xiàn)顯示，雙特異性T 細(xì)胞連接子（BiTEs），利用單鏈雙特異性抗體技術(shù)將同一或不同細(xì)胞上兩種單克隆抗體（抗原表位）連接起來(lái)。局限性為半衰期短，內(nèi)源的效應(yīng)T 細(xì)胞不足以及嚴(yán)重副作用。

第四代實(shí)體瘤CART 的研制由劉杰教授團(tuán)隊(duì)和儲(chǔ)以微教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)展。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：裸鼠皮下荷瘤胃癌細(xì)胞，第8、14、20 天靜脈注射HER2-CART 細(xì)胞，HER2-CART 顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)裸鼠生存期。第四代GPC3-CAR 結(jié)構(gòu)以CD3 抗體代替?zhèn)鹘y(tǒng)CAR的胞內(nèi)段，并mRNA 電轉(zhuǎn)T 細(xì)胞表達(dá)。目前研究已完成并發(fā)表了相關(guān)論文。

第三，“腫瘤新抗原”疫苗比CAR-T 治療更安全。

劉杰教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)展的另一項(xiàng)工作是國(guó)家基金委的重點(diǎn)項(xiàng)目——新抗原疫苗的研制工作。研發(fā)流程主要包括以下四個(gè)方面。一是新抗原人工智能預(yù)測(cè)。基于人工智能與表位肽預(yù)測(cè)融合排序，構(gòu)建腫瘤個(gè)體化抗原肽組合疫苗。二是新抗原免疫功能評(píng)估。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)確定新抗原肽的免疫原性以及特異性。三是新抗原疫苗臨床試驗(yàn)。設(shè)計(jì)新抗原肽組合疫苗Ⅰ期臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證其安全性和有效性。四是新抗原肽組合疫苗注射前后T 細(xì)胞發(fā)生變化的機(jī)制研究。目前該項(xiàng)研究的結(jié)果已經(jīng)發(fā)布。

2017 年7 月13 日《自然》（Nature）雜志同一天發(fā)布兩項(xiàng)基于新抗原的個(gè)體化腫瘤疫苗研究，文章結(jié)論是腫瘤新抗原臨床應(yīng)用安全、可行且療效明顯?！蹲匀弧罚∟ature，2017 年7 月）報(bào)道6 例晚期惡性黑色素瘤接受Neoantigen 對(duì)應(yīng)的抗原肽制備的疫苗治療，其中4 例注射后25 個(gè)月維持無(wú)復(fù)發(fā)，2 例注射后出現(xiàn)復(fù)發(fā)者接受PD-1 抗體治療后完全緩解。Nature 雜志（2017 年）報(bào)道13 例晚期黑色素瘤注射neoantigen 對(duì)應(yīng)RNA 制備的個(gè)體化疫苗后，無(wú)復(fù)發(fā)生存期明顯延長(zhǎng)。

腫瘤新抗原（neoantigen）是由腫瘤細(xì)胞基因變異產(chǎn)生，是一種位于腫瘤細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物的抗原表位肽（8～12 肽），不存在于正常組織。具有強(qiáng)免疫原性，使免疫學(xué)會(huì)識(shí)別其為“非我”抗原。新抗原（neoantigen）可為提升腫瘤疫苗的療效提供幫助。那么，新抗原人工智能預(yù)測(cè)又是什么？它是基于人工智能與表位肽預(yù)測(cè)融合排序系統(tǒng)構(gòu)建腫瘤個(gè)體化抗原肽組合。腫瘤特異性突變篩選，原代腫瘤細(xì)胞尋找非同義突變，外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC 進(jìn)行HLA Ⅰ、Ⅱ分型，人工智能SEPPA，抗原表位與HLA 親和力預(yù)測(cè)。CE-BLAST 抗原表位識(shí)別TCR 相似度預(yù)測(cè)，再通過(guò)融合排序系統(tǒng)的突變嵌合親和力差異、基因表達(dá)水平、TCR 結(jié)合概率、腫瘤突變負(fù)荷、基因功能評(píng)估、陰性過(guò)濾等計(jì)算規(guī)則，獲得潛在新抗原肽組合。

為什么現(xiàn)在能研制腫瘤新抗原疫苗而以前不能？劉杰教授認(rèn)為，這是因?yàn)槿斯ぶ悄芎痛髷?shù)據(jù)出現(xiàn)之前，很多抗原都是正常細(xì)胞有而腫瘤表達(dá)高的相關(guān)抗原；而借助人工智能和大數(shù)據(jù)后，就能找到健康細(xì)胞沒(méi)有而腫瘤細(xì)胞有的抗原表位肽（8～12 肽），找到后進(jìn)行大量的排序和人工智能評(píng)估，觀察是否有體外激活功能，再通過(guò)制備疫苗進(jìn)行機(jī)體免疫治療，在切除腫瘤后立刻進(jìn)行治療預(yù)防雙管齊下，注射特異性的新抗原疫苗。通過(guò)這項(xiàng)免疫技術(shù)治療非常安全，效果較為理想，而CAR-T 治療尚無(wú)法避免細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生。

專(zhuān)家小傳

劉杰教授，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院消化科主任、博士生導(dǎo)師、教授、主任醫(yī)師。擅長(zhǎng)癌前病變的早期預(yù)警及干預(yù)、消化腫瘤的綜合診治及康復(fù)，消化系統(tǒng)疑難雜癥。國(guó)家“長(zhǎng)江學(xué)者”獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃特聘教授；國(guó)家“杰出青年基金”獲得者；國(guó)家人事部新世紀(jì)百千萬(wàn)人才工程“國(guó)家級(jí)人選”；國(guó)家教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才”資助計(jì)劃獲得者；上海市“優(yōu)秀學(xué)科帶頭人”及上海市“領(lǐng)軍人才”。復(fù)旦大學(xué)消化疾病研究所所長(zhǎng)，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院雙聘教授。留學(xué)美國(guó)Thomas Jefferson 大學(xué)6 年。主要從事臨床疑難病例研究及消化腫瘤的綜合診治，包括腫瘤的早期預(yù)警，腫瘤高?；颊吆Y選及干預(yù)，腫瘤患者的個(gè)體化精準(zhǔn)綜合治療及康復(fù)方案選擇?？寺〕鰢?guó)際上未見(jiàn)報(bào)道的肝硬化癌變?cè)缙陬A(yù)警新基因，具有重要的癌變預(yù)警價(jià)值；率先建立核酸適配體篩選平臺(tái)并鑒定出抗胃癌、肝癌和乙肝特異性核酸適配體，填補(bǔ)本領(lǐng)域國(guó)內(nèi)空白，提供了腫瘤早診及抗乙肝新藥創(chuàng)制全新策略；臨床研究中積極走轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)之路，在Nature 子刊發(fā)表的臨床病例研究被美國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)推舉為繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育教材。利用模糊數(shù)學(xué)理論建立了胃癌前病變癌變概率的判別模式，對(duì)高危癌前病變的判定具有重要價(jià)值。先后獲得世界胃腸病學(xué)大會(huì)“青年醫(yī)師獎(jiǎng)”、省級(jí)“十大杰出青年” 、賽克勒中國(guó)醫(yī)師“年度獎(jiǎng)”、上海市“優(yōu)秀學(xué)科帶頭人” 、教育部“長(zhǎng)江學(xué)者”特聘教授等榮譽(yù)。