熱水浸提法提取鹿茸膠原蛋白工藝研究

高鴻蒙 王智慧 雅茹

1 試驗(yàn)方法

1.1 膠原蛋白的提取

取干鹿茸30g，粉碎勻漿，加入1500ml蒸餾水勻漿抽提，離心分（10000r/min，20min）。殘?jiān)?倍NaOH溶液攪拌過(guò)夜，離心分離（10000r/min，20min），重復(fù)用堿洗三次，去除上清液，將沉淀用蒸餾水沖洗，離心（10000r/min，20min），如此反復(fù)2次。加60%乙醇1000mL，4℃浸提48h，紗布過(guò)濾，離心，上清液于50℃、60r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，提取液置于截流分子量范圍8～15kDa的透析袋中，對(duì)蒸餾水透析24h，-20℃預(yù)凍24h，凍干，即得鹿茸膠原。

1.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用DYCZ-24D型垂直板凝膠電泳槽，采用濃度為10%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠，濃縮膠電壓為70mV，分離膠電壓140mV。采用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色，最后用脫色液（甲醇∶冰醋酸∶蒸餾水=4.5∶4.5∶1）脫色，至背景清晰，觀測(cè)分子量范圍。電泳各儲(chǔ)液放入0～2 ℃的冰箱中，隨取隨用;電泳緩沖液pH值為8.3。采用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為：兔磷酸化酶B（97400）;牛血清白蛋白（66200）;兔肌動(dòng)蛋白（43000）;牛碳酸酐酶（31000）;胰蛋白酶抑制劑（20100）;雞蛋清溶菌酶（14400）。

配制完膠后，迅速沿著電泳槽的玻璃板邊緣將膠倒入電泳槽，先到分離膠，至膠液面離玻璃板凹槽3.5厘米左右。然后在膠面上輕輕鋪1cm高的水，垂直放置20～30分鐘左右使之凝聚。然后吸出膠面上的水，倒入濃縮膠，使膠液面與玻璃板凹槽處平齊，然后插入梳子，室溫放置使其凝固。待凝膠完全凝后，取下梳子，拆掉膠條，重新安裝好電泳槽后，倒入電極緩沖液。檢查板是否漏液，若不漏則可點(diǎn)樣了。

點(diǎn)樣：將樣品液與加樣緩沖液等體積混合后，即可用微量注射器在孔中點(diǎn)樣。每孔上樣量為20μL。加樣完畢后，打開(kāi)電源（負(fù)極接上槽，正極接下槽），電流初為15mA，當(dāng)前沿指示劑進(jìn)入分離膠后調(diào)節(jié)電流為20mA。待指示劑遷移至距下口約1cm時(shí)，關(guān)閉電源。整個(gè)電泳所需時(shí)間約為6h。

1.3 紫外分析

對(duì)提取的膠原溶液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量其吸收光譜。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用石英比色皿，分光光度計(jì)的波長(zhǎng)選在200一500nm之間。

1.4 氨基酸分析

取上述膠原凍干品約25mg，2mL6mol/LHCl水解24h，蒸干，采用1100系列高效液相進(jìn)行氨基酸含量測(cè)定。衍生試劑：2，4-二硝基氟苯（FDNB）;流動(dòng)相A：乙腈∶水（55∶45）;流動(dòng)相B：KH2PO4，PH=7.2;梯度洗脫，流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL。

在20 種常見(jiàn)氨基酸中，甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量最高，其中甘氨酸含量幾乎占了1/3，為33.24% ，脯氨酸和丙氨酸含量分別為11.64% 和11.78% ;組氨酸和酪氨酸含量較低，沒(méi)有檢測(cè)出胱氨酸;非常見(jiàn)氨基酸———羥脯氨酸的含量也非常高，為11.20% 。另外，羥脯氨酸和脯氨酸比值為0.8，和Ⅰ型膠原（0.7～0.8）一致。

2 結(jié)果分析

2.1 電泳結(jié)果分析

1.對(duì)提取的膠原蛋白進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)為3倍，5倍，10倍。

電泳圖片如下：見(jiàn)圖一.

說(shuō)明：圖片中所顯示的，第一條帶為標(biāo)準(zhǔn)蛋白maker，2-4條帶為稀釋3倍的膠原蛋白樣品，5-7條帶為稀釋5倍的膠原蛋白樣品，8-10條帶為稀釋10倍的膠原蛋白樣品，電泳圖片表明稀釋5倍的條帶比較清晰。圖片顯示蛋白分子量為116kDa左右，符合相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，提取的膠原為Ⅱ型膠原蛋白。

2.2 紫外分析結(jié)果

通過(guò)在200—500nm的波長(zhǎng)下對(duì)稀釋不同倍數(shù)的樣品進(jìn)行掃描，獲得了較好的效果，最大吸收波長(zhǎng)均在230nm，與文獻(xiàn)報(bào)道的Ⅰ型膠原蛋白的最大吸收波長(zhǎng)一致。結(jié)果見(jiàn)圖四

3 結(jié)論

（1）鹿茸為原料提取膠原蛋白，方法簡(jiǎn)便易行，從對(duì)其冷藏條件下為凍狀可以鑒定出所提取的物質(zhì)為膠原。

（2）從電泳的結(jié)果看，所提取的物質(zhì)為膠原的水解產(chǎn)物，膠原蛋白或者是明膠，因?yàn)槟z原的分子量為300kDa，但其水解后的產(chǎn)物膠原蛋白的分子量為十萬(wàn)左右，符合文獻(xiàn)的報(bào)道。

（3）從紫外分析的結(jié)果看，所提取的物質(zhì)中含有Ⅰ型膠原蛋白。

基金項(xiàng)目：錫林郭勒職業(yè)學(xué)院研究課題（編號(hào)：QN-2019-02）。

（作者單位：錫林郭勒職業(yè)學(xué)院）