基于TT51-1水稻種子標準曲線檢測的可靠性分析

袁建琴 孔艷彪 李麗

摘 要：為了分析在同一個實驗室的2臺不同型號的實時熒光定量PCR儀（擴增曲線和標準曲線的相關(guān)參數(shù)）可比性，在常規(guī)條件下，使用同一批號的試劑，將標準品及同一水稻種子樣品TT51-1在2臺熒光定量PCR儀上進行擴增，對標準曲線的參數(shù)及分析結(jié)果進行比對，分析其一致性。結(jié)果表明，作為單一的檢測系統(tǒng)，運用同一批號試劑對相同標準品及待檢樣品的試驗中，2臺實時熒光定量PCR儀測定的結(jié)果差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。通過對標準曲線的相關(guān)參數(shù)和待檢測樣品的檢測結(jié)果的分析，可以判定實驗室存在的2臺實時熒光定量PCR儀檢測的結(jié)果的一致性，可確保檢測結(jié)果可靠。

關(guān)鍵詞：TT51-1水稻;標準曲線;轉(zhuǎn)基因成分檢測;實時熒光定量PCR;可靠性分析

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190830004

基金項目：山西省高等學(xué)校教學(xué)改革創(chuàng)新項目“開放式生物技術(shù)專業(yè)實踐教學(xué)體系的研究與實踐”（項目編號：J2018079）;山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金資助“基于DNA甲基化探究雙酚A致Marc-145細胞毒性機制”（項目編號：2016ZZ09）; 山西省科技攻關(guān)項目“主要轉(zhuǎn)基因深加工農(nóng)產(chǎn)品定量檢測技術(shù)研究”（項目編號：20140311025-3）

實時熒光定量PCR技術(shù)在諸多領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用，其領(lǐng)域涉及動物學(xué)、植物學(xué)、環(huán)境生物學(xué)和醫(yī)藥衛(wèi)生等[1-3]。由于實時熒光定量PCR技術(shù)只要設(shè)計出能夠?qū)?yīng)檢測樣品的引物與探針，就能夠?qū)崿F(xiàn)特異性地結(jié)合的特點，也被廣泛地運用在對環(huán)境中的微生物變化進行檢測的方面[4-8]。雖然實時熒光定量技術(shù)擁有很強的特異性，很好的重復(fù)性，較高的自動化程度以及較快的檢測速度，但是影響實時熒光定量PCR技術(shù)的因素仍舊不能忽視。樣品的處理、試劑的選擇與儲存、核酸的提取、儀器的擴增、操作的規(guī)范性以及對于結(jié)果的分析都是可能影響到試驗的最終結(jié)果的因素[9-12]。對于實驗過程之中可能對于實驗結(jié)果造成影響的因素進行分析，對應(yīng)尋找合適的解決措施與方法，可以提高檢驗檢疫的精確度。特別是隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和分子生物學(xué)研究手段在檢測領(lǐng)域的運用，同一實驗室內(nèi)有多臺實時熒光定量PCR儀的情況變得越來越常見。判斷2臺實時熒光定量PCR儀擴增與檢測結(jié)果的一致性，是實現(xiàn)實驗室的規(guī)范標準化亟待解決的問題。為此，本試驗在同一條件下，將100% TT51-1水稻標準物質(zhì)和待測樣品（1% TT51-1水稻標準物質(zhì)）在2臺實時熒光定量PCR儀上由同一操作人員使用相同試劑進行擴增，對標準曲線的相關(guān)參數(shù)和檢測結(jié)果進行分析，以此記錄和比照不同儀器的檢測結(jié)果是否具有的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水稻材料

1% TT51-1水稻標準物質(zhì)作為待測樣品、100% TT51-1水稻標準物質(zhì)作為陽性標準品（均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心提供）。

1.1.2 主要試劑

植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（DP130227，TIANFGEN（BEIJING） CO.LTD）、無水乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、β-巰基乙醇、適用于實時熒光定量的TaqDNA聚合酶以及緩沖液、dNTP等實驗室常規(guī)分析純試劑。

1.1.3 主要儀器

試驗中所用2臺實時熒光定量PCR儀，見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及純化

本試驗參照植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書進行提取基因組DNA。

1.2.2 DNA溶液的濃度和純度

開啟核酸蛋白定量檢測儀，用10μL移液器將2μL TE加入到測量孔中進行調(diào)零。

將2μL提純的DNA溶液加到測量孔，檢測DNA濃度，記錄結(jié)果，清洗測量杯，重復(fù)檢測DNA濃度3次并計算平均值。

1.2.3 樣品制備

初始模版的制備：將提取好并檢測濃度后的 DNA 溶液用滅菌的超純水稀釋至50ng/μL來作為初始的模板。

濃度梯度溶液的制備：用滅菌的超純水對初始模板進行梯度稀釋，分別為10ng/μL、2ng/μL、0.4ng/μL、0.08ng/μL。

1.3 實時熒光定量PCR檢測

對樣品進行實時熒光定量PCR，檢測對象為水稻轉(zhuǎn)化體TT51-1和PLD基因。陽性標準品為100%的水稻標準物質(zhì)，陰性對照為鮭魚精子DNA，空白對照是滅菌的ddH2O。檢測方法和引物探針參照農(nóng)業(yè)部2122號公告-8-2014[13]。

1.3.1 實時熒光定量 PCR 所用的引物與探針

實時熒光定量 PCR 所用的引物和探針見表2。

1.3.2 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系

試驗中TT51-1熒光定量PCR體系見表3，PLD熒光定量PCR體系見表4。

1.3.3 實時熒光定量PCR循環(huán)參數(shù)

實時熒光定量PCR體系見表5[14-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA含量檢測結(jié)果

100% TT51-1水稻標準物質(zhì)的基因組DNA濃度和純度檢測結(jié)果，見表6。

提取100% TT51-1水稻標準物質(zhì)的基因組DNA的濃度為538.5ng/μL，在25ng/μL以上，OD260/OD280為1.86，在1.7～2.0之間;OD260/OD230為2.04，大于2，說明所提取的DNA濃度與純度均符合實時熒光定量PCR的要求。

2.2 實時熒光定量PCR對于樣品的檢測結(jié)果（機型Ⅰ）

2.2.1TT51-1實時熒光定量PCR檢測標準曲線

100%TT51-1水稻標準物質(zhì)DNA在機型Ⅰ上的標準曲線如圖1所示。

從圖1可以看出，TT51-1擴增效率為103.3%，R2為0.994>0.98，標準曲線斜率為-3.244≥-3.6，并且≤-3.1，能夠?qū)悠愤M行準確判定。

2.2.2TT51-1實時熒光定量 PCR 檢測的擴增曲線

圖2中，陰性對照和空白對照均無典型擴增曲線，待測樣品、陽性標準物質(zhì)TT51-1均有典型擴增曲線。

2.2.3PLD基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測的標準曲線

PLD在機型Ⅰ上的標準曲線如圖3所示。

從圖3可以看出，PLD擴增效率為102.2%，R2為0.996>0.98，標準曲線斜率為-3.270≥-3.6，并且≤-3.1，能夠?qū)悠愤M行準確判定。

2.2.4 PLD實時熒光定量PCR檢測的擴增曲線

PLD在機型Ⅰ上的擴增曲線如圖4。

在圖 4 中，陰性對照和空白對照均無典型擴增曲線，樣品、陽性對照有典型擴增曲線。

2.2.5 Ct值和拷貝數(shù)

TT51-1和PLD基因的Ct值和拷貝數(shù)見表7。

2.2.6 樣品中轉(zhuǎn)化體含量的計算

樣品中TT51-1轉(zhuǎn)化體的含量可通過公式：C轉(zhuǎn)基因含量（%）=nTT51/nPLD*100%。計算結(jié)果見表8。

從表中可以得知，所檢樣品中含有TT51-1的轉(zhuǎn)化體含量為1.04%。

2.3 實時熒光定量PCR對樣品的檢測結(jié)果（機型Ⅱ）

2.3.1 TT51-1實時熒光定量PCR檢測的標準曲線

TT51-1在機型Ⅱ上的標準曲線如圖5所示。

從圖5可以看出，TT51-1擴增效率為104.8%，R2為0.988>0.98，標準曲線斜率為-3.211≥-3.6，并且≤-3.1，陰性對照與空白對照均沒有典型的擴增曲線，能夠?qū)悠窋?shù)據(jù)進行準確判定。

2.3.2 TT51-1實時熒光定量 PCR 檢測的擴增曲線

TT51-1在機型Ⅱ上的擴增曲線如圖6所示。

在圖6中，陰性對照和空白對照均無典型擴增曲線，待測水稻樣品和陽性對照都有典型擴增曲線。

2.3.3 PLD實時熒光定量PCR檢測的標準曲線

PLD基因在機型Ⅱ上的標準曲線如圖7。

從圖7可以看出，PLD擴增效率為103.8%，R2為0.985>0.98，標準曲線斜率為-3.233≥ -3.6，并且≤-3.1，能夠?qū)悠窋?shù)據(jù)進行準確判定。

2.3.4 PLD實時熒光定量PCR檢測的擴增曲線

PLD在機型Ⅱ上的擴增曲線如圖8所示。

在圖8中，陰性對照和空白對照均無典型擴增曲線，待測樣品和陽性對照均有典型擴增曲線。

2.3.5 Ct值和拷貝數(shù)

TT51-1及PLD基因的Ct值和拷貝數(shù)見表9。

2.3.6 樣品中轉(zhuǎn)化體含量計算

轉(zhuǎn)化體含量的計算結(jié)果見表10。

從表中可以得知，樣品中含有TT51-1的轉(zhuǎn)化體含量為0.97%。

3 討論

3.1 水稻基因組DNA的提取

由于原有的試劑盒法雖然提取步驟相對簡單，操作時間較短，但是提取效率低，試驗用改良試劑盒法提取水稻基因組DNA。改良試劑盒法增加苯酚、氯仿和異戊醇的抽提步驟，使提取的DNA濃度，與說明書理論值相比，提升400%。通過OD260/OD280和OD260/OD230可以判斷抽提的核酸的純度是否符合試驗的要求。試驗中所提取樣液的OD260/OD280在1.7～1.9之間，純度較好，濃度遠高于25 μL;OD260/OD230大于2.0，說明改良試劑盒法提取的DNA可以作為后續(xù)試驗熒光定量PCR的模板。

3.2 標準曲線與擴增曲線的分析

圖1、圖3是在機型Ⅰ上水稻轉(zhuǎn)化體TT51-1和PLD基因的標準曲線，圖5、圖7是在機型Ⅱ上TT51-1和PLD的標準曲線，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心提供的100% TT51-1標準物質(zhì)作為陽性標準品。在標準曲線的參數(shù)中，相關(guān)系數(shù)需滿足大于0.98，擴增效率需滿足大于90%，小于110%。圖1、圖3、圖5、圖7的相關(guān)系數(shù)與擴增效率均滿足需求，可以用來計算待測樣品的最初拷貝數(shù)。圖2、圖4是在機型Ⅰ上TT51-1和PLD的擴增曲線，圖6、圖8是在機型Ⅱ上TT51-1和PLD的擴增曲線?？梢钥闯?，曲線的拐點都比較明顯，整體的平行性好。曲線在指數(shù)期的斜率較大，這表明PCR擴增效率比較高。圖中的待測樣品擴增曲線在第25個循環(huán)后進入指數(shù)期，說明樣品的起始拷貝數(shù)比較低。

3.3 2種機型擴增結(jié)果的比較

3.3.1 基于系統(tǒng)擴增曲線和標準曲線的分析

利用100% TT51-1水稻標準物質(zhì)在2臺PCR儀上檢測1%水稻標準物質(zhì)的TT51-1擴增結(jié)果，如圖2和圖6所示。圖中，基因組DNA濃度為50ng/μL、10ng/μL、2ng/μL、0.4ng/μL、0.08ng/μL的Ct值在機型Ⅰ和機型Ⅱ上的平均平均值分別為26.89、30.17、32.92、35.01、36.67和27.06、30.62、32.65、35.40、36.94，2臺儀器的曲線都呈現(xiàn)標準的“S”型擴增，曲線之間的間距均一;從標準曲線圖上可以看出，2臺不同儀器繪制的標準曲線斜率分別為-3.244、-3.211，都和理論斜率值接近，相關(guān)系數(shù)也都大于0.98，因此，這次擴增有效，并且擴增效率比較高。100% TT51-1水稻標準物質(zhì)在2臺PCR儀的擴增結(jié)果（PLD）如圖4和圖8所示。圖中，基因組DNA濃度為50ng/μL、10ng/μL、2ng/μL、0.4ng/μL、0.08ng/μL的Ct值在機型Ⅰ和機型Ⅱ上的平均值分別為29.79、32.43、34.40、36.66、38.63和27.03、30.49、32.88、34.90、36.55，2臺儀器的曲線也都呈現(xiàn)標準的“S”型擴增，曲線之間的間距均一;從標準曲線圖上可以看出，2臺不同儀器繪制的標準曲線斜率分別為-3.270、-3.233，都和理論斜率值接近，相關(guān)系數(shù)也都大于0.98，因此，這次擴增有效，并且擴增效率比較高。選擇這樣的濃度梯度，滿足點分布均勻和具備定量極限處數(shù)值，繪制的曲線更具有代表性。

3.3.2 對于樣品檢測結(jié)果的分析

2臺儀器均檢出1%水稻中的TT51-1轉(zhuǎn)化體含量，在機型Ⅰ中為1.04%，機型Ⅱ中為0.97%（真實值為1%），說明機型Ⅰ和機型Ⅱ檢測結(jié)果與實際值無顯著差異（P>0.05）。

4 結(jié)論

本試驗利用100% TT51-1轉(zhuǎn)化體標準物質(zhì)和待測水稻種子粉末（1% TT51-1轉(zhuǎn)化體標準物質(zhì)）對實驗室2臺不同型號實時熒光定量PCR儀進行結(jié)果比對，表明2臺實時熒光定量PCR儀檢測結(jié)果無顯著差異，均可滿足科研及檢測需要。

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