尋常型銀屑病皮損中Cx蛋白及其mRNA表達(dá)及與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究

夏米娜，劉彥群，翟曉翔

（1.徐州市中醫(yī)院，江蘇徐州221000；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇徐州221000）

銀屑病是一種有遺傳背景的自身免疫性皮膚病，30%的銀屑病患者其發(fā)病機(jī)制主要和免疫、遺傳、感染以及環(huán)境因素有關(guān)。近年來(lái)，有學(xué)者提出，銀屑病的發(fā)病與病情發(fā)展與細(xì)胞間信息傳遞的異常有關(guān)，縫隙連接是細(xì)胞間信息傳遞的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，縫隙連接（Cx）蛋白是縫隙連接的最小功能單位，Cx蛋白的水平高低直接影響細(xì)胞的新陳代謝、增殖、分化及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[1]。本文旨在研究分析部分Cx蛋白及其mRNA在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)水平及其與病情嚴(yán)重程度的聯(lián)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 選取2015年1月—2017年12月我院接診治療的尋常型銀屑病患者80例作為研究組，其中男46例，女34例，年齡20～65歲，平均（36.1±4.4）歲，病程 3個(gè)月～15年，所選取的患者病理組織檢測(cè)結(jié)果及臨床癥狀均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)尋常型銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有心、肝、腎、腦、血液等嚴(yán)重系統(tǒng)疾病者；②半年內(nèi)接受過(guò)系統(tǒng)或局部銀屑病治療者；③免疫功能紊亂者；④合并患有其他皮膚科疾病者；⑤長(zhǎng)期或近期接受免疫抑制機(jī)或生物制劑治療者；⑥孕期及妊娠期女性患者。

選取同期在我院進(jìn)行體檢的健康人80例作為對(duì)照組，其中男43例，女37例，年齡18～65歲，平均（35.5±3.9）歲。

研究組和對(duì)照組年齡、性別一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可進(jìn)行研究對(duì)比，本研究所選取的患者均事先知情，簽署知情通知書(shū)并獲得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 免疫組化試劑盒，美國(guó)Sigma公司；基因組擴(kuò)增試劑盒，美國(guó)Sigma公司；DAB顯色試劑盒，美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 B203LED型光學(xué)顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；DMI6000B型倒置熒光顯微鏡，美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 病情評(píng)定 采用銀屑病皮損面積與嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)分對(duì)患者病情進(jìn)行評(píng)定[2]。根據(jù)PASI總分進(jìn)行病情分級(jí)：PASI≤15為輕度，15＜PASI＜30 為中度，PASI≥30 為重度。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) 采集對(duì)照組和研究組皮損及正常皮膚組織，制作2份切片，分別用作蛋白及其mRNA檢測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色操作，分別采用光學(xué)顯微鏡和倒置熒光顯微鏡對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察，以胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，以無(wú)明顯染色或組織色與背景色一致為陰性對(duì)照。400倍視野下取4個(gè)有代表性且非連續(xù)的視野，觀察切片染色深度和分布情況，采用Image pro-Plus6.0軟件計(jì)算分析皮損組織與健康皮膚Cx蛋白及其對(duì)應(yīng)mRNA的光密度平均值IOD/AOI。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 選用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用X+S（mean±SD）描述，多組間比較采用F值檢驗(yàn)，2組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cx蛋白表達(dá)比較 4組患者Cx26蛋白平均光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.620，P=0.000），輕度患者Cx26蛋白平均光密度值高于對(duì)照組（t=20.461，P=0.000），中度患者Cx26蛋白平均光密度值高于輕度患者（t=7.082，P=0.004），重度患者Cx26蛋白平均光密度值高于輕度患者（t=10.083，P=0.002）。4組患者Cx43蛋白平均光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.911，P=0.000），輕度患者 Cx43蛋白平均光密度值高于對(duì)照組（t=11.274，P=0.002），中度患者Cx43蛋白平均光密度值高于輕度患者（t=4.382，P=0.004），重度患者 Cx43 蛋白平均光密度值高于輕度患者（t=5.773，P=0.004）。4組Cx30、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx37 及 Cx45 蛋白平均光密度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 mRNA表達(dá)比較 4組患者Cx26蛋白對(duì)應(yīng)mRNA平均光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.988，P=0.001），輕度患者Cx26蛋白對(duì)應(yīng)mRNA平均光密度值高于對(duì)照組（t=9.151，P=0.001），中度患者Cx26蛋白對(duì)應(yīng)mRNA平均光密度值高于輕度患者（t=5.044，P=0.004），重度患者Cx26蛋白對(duì)應(yīng) mRNA平均光密度值高于輕度患者（t=7.312，P=0.002）。4組患者Cx43蛋白對(duì)應(yīng)mRNA平均光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.149，P=0.000），輕度患者 Cx43蛋白對(duì)應(yīng)mRNA平均光密度值高于對(duì)照組（t=7.422，P=0.002），中度患者Cx43蛋白對(duì)應(yīng)mRNA平均光密度值高于輕度患者（t=7.310，P=0.002），重度患者Cx43蛋白對(duì)應(yīng)mRNA平均光密度值高于輕度患者（t=8.579，P=0.001）。4 組 Cx30、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx37及Cx45蛋白對(duì)應(yīng)mRNA平均光密度值相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 2。

2.3 相關(guān)性分析 比較分析表1、表2中不同病情患者CX蛋白及其mRNA表達(dá)水平，Cx30、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx37、及 Cx45及其 mRNA 在不同病情嚴(yán)重程度患者間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），輕度、中度和重度患者Cx26和Cx43蛋白及其mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Cx26（r=0.624，P＜0.01）和 Cx43（r=0.595，P＜0.01）及其 mRNA 與 PASI評(píng)分存在顯著的正相關(guān)性。

3 討論

銀屑病是臨床皮膚科的常見(jiàn)疾病，有影響因素多、病程長(zhǎng)、病情頑固易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制受多基因遺傳、免疫、環(huán)境等因素影響。遺傳因素：銀屑病屬于一種常見(jiàn)的多基因且復(fù)發(fā)的遺產(chǎn)疾病，以及成為當(dāng)今各國(guó)皮膚病和遺傳學(xué)家研究的重點(diǎn)對(duì)象。研究數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)ANs在漢族人群中進(jìn)行精密定位后發(fā)現(xiàn)，HLA-C成為易感基因[3]。在各國(guó)銀屑病患者中，13q21-32和17q22-25證實(shí)LCE基因?qū)儆谝赘谢?，和銀屑病的病理學(xué)改變以及角質(zhì)細(xì)胞的增生過(guò)度有相關(guān)性。免疫因素：銀屑病不僅表現(xiàn)在皮膚損傷，并且還存在單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，主要的病理特征是T淋巴細(xì)胞真皮浸潤(rùn)，主要是通過(guò)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫在銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，T淋巴細(xì)胞會(huì)活化并釋放白細(xì)胞介素（IL），IL-6和IL-8受到刺激后會(huì)促進(jìn)膠原細(xì)胞增生，出現(xiàn)白細(xì)胞凝聚和黏附。巨噬細(xì)胞會(huì)促進(jìn)IL-α和干擾素（IFN）-γ的分泌，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，會(huì)造成白細(xì)胞的外滲。多種細(xì)胞共同作用發(fā)生免疫反應(yīng)，角質(zhì)細(xì)胞作為靶細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子間的表達(dá)，誘導(dǎo)表皮發(fā)生免疫反應(yīng)。研究顯示銀屑病患者的病變位置棘層細(xì)胞增厚，且末梢神經(jīng)增生，長(zhǎng)時(shí)間在較高的炎性水平中，經(jīng)過(guò)治療患病處，肥大細(xì)胞密度降低，但是與正常相比，仍然很高[4]。因此，其是造成銀屑病經(jīng)常反復(fù)發(fā)病的原因。環(huán)境因素：銀屑病發(fā)病和季節(jié)有相關(guān)性，銀屑病的初次發(fā)病在春季的時(shí)間較多，在冬季會(huì)加重，日照時(shí)間也是一種不利因素。吸煙會(huì)促進(jìn)中性粒細(xì)胞的活化，可以改變吞噬細(xì)胞的氧化代謝，加重炎癥反應(yīng)，對(duì)酶的釋放有促進(jìn)作用，從而加重患者的皮損狀況。

表1 對(duì)照組和研究組CX蛋白平均光密度值比較 （mean±SD）

表2 對(duì)照組和研究組CX蛋白對(duì)應(yīng)mRNA平均光密度值比較 （mean±SD）

Cx蛋白是細(xì)胞縫隙連接的基本功能單位，細(xì)胞縫隙連接是廣泛存在于除血細(xì)胞和骨骼細(xì)胞外的其他細(xì)胞間的一種連接形式，細(xì)胞通過(guò)縫隙連接進(jìn)行信息、物質(zhì)和能量的傳遞交換，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝、增殖和分化，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，目前臨床已發(fā)現(xiàn)的Cx蛋白約有20多種，根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行命名，如 Cx26、Cx30、Cx32、Cx37、Cx40、Cx43等，不同的連接蛋白參與調(diào)節(jié)不同的生理活動(dòng)[5-8]。Cx26參與調(diào)節(jié)控制細(xì)胞的信息傳遞及分化，在內(nèi)耳和毛囊外毛根鞘有顯著的高表達(dá)，Cx26的異常突變對(duì)皮膚損傷和耳聾與有著直接的影響，臨床差異較大，導(dǎo)致皮膚過(guò)度角化的情況相對(duì)較多[9-10]。Cx30主要表達(dá)于表皮、大腦和內(nèi)耳中，其突變可引起汗性外胚層發(fā)育不良，又稱為Clouston綜合癥，臨床表現(xiàn)為甲發(fā)育不良、掌跖角化過(guò)度、毛發(fā)稀疏，部分患者并發(fā)有聽(tīng)力減退、智力障礙、斜視等，臨床差異較大。Cx31主要表達(dá)于表皮顆粒層，作用于角質(zhì)形成細(xì)胞分化晚期，其突變可引起可變性紅斑角化癥，多發(fā)病于出生時(shí)或早年，臨床特征主要表現(xiàn)為正常皮膚或紅斑上出現(xiàn)角化過(guò)度性斑片，斑片存在時(shí)間及部位無(wú)規(guī)律性，少部分持久存在。Cx43分布較為廣泛，幾乎存在于所有組織和細(xì)胞中，其突變對(duì)皮膚、毛發(fā)、神經(jīng)退化等均有一定的影響。多項(xiàng)研究指出，在皮膚病中，Cx蛋白最明顯的表達(dá)是上調(diào)增加角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化，例如Cx26和Cx43在銀屑病斑塊及腫瘤乳頭瘤中的顯著升高[11，13]。

本文研究中，2 組 Cx30、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx37及Cx45蛋白及其對(duì)應(yīng)mRNA表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），研究組 Cx26、Cx43 蛋白及其對(duì)應(yīng)mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），不同病情嚴(yán)重程度的患者Cx26和Cx43蛋白及其mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Cx26（r=0.624，P＜0.01）和 Cx43（r=0.595，P＜0.01）及其 mRNA 表達(dá)水平與PASI評(píng)分存在顯著的正相關(guān)性，說(shuō)明Cx26和Cx43與銀屑病的發(fā)病及病情發(fā)展存在顯著的緊密聯(lián)系，其表達(dá)水平高低可以在一定程度上反應(yīng)病情程度。本文研究結(jié)果與Shaker等[14]和Boehncke[15]的結(jié)果保持一致。

綜上所述，本文通過(guò)對(duì)比尋常型銀屑病患者皮損組織與健康人正常皮膚中部分Cx蛋白及其mRNA表達(dá)水平的差異，分析不同病情患者指標(biāo)表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度的聯(lián)系，得出Cx26和Cx43及其mRNA表達(dá)水平與患者PASI評(píng)分正相關(guān)，其表達(dá)水平的高低可以在一定程度上直接反應(yīng)病情程度，為銀屑病臨床治療中病情診斷及監(jiān)控提供樂(lè)一些理論參考，但研究?jī)?nèi)容相對(duì)較為局限，對(duì)于Cx蛋白與上述疾病的作用機(jī)制還需要更進(jìn)一步的研究支持。