p53及p16在皮膚鱗狀細(xì)胞癌和鮑溫病中的表達(dá)及意義

鄒愛玲，石年，石嫻，解翠林，顧磊，陳用軍，牛彬

[鄂東醫(yī)療集團市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院），湖北黃石435000]

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）好發(fā)于老年人的日光暴露部位皮膚（如頭面部、頸背部等）。長期慢性紫外線照射被認(rèn)為是主要的致癌風(fēng)險因素。而且CSCC在人群中的發(fā)病率越來越高，更嚴(yán)重的是其轉(zhuǎn)移率在某些人群中高達(dá)10%[1]。因此了解參與皮膚癌發(fā)生及發(fā)展的基因與分子學(xué)機制顯然非常有必要性。事實上其發(fā)病機制尚不十分明確，到目前為止只有部分基因分子異常表達(dá)被人們所認(rèn)識。由紫外線引起的p53腫瘤抑制基因突變失活，就是1個典型的例子。另外還有細(xì)胞周期抑制劑p16蛋白也常在皮膚癌中異常表達(dá)[2]。因此本研究將鮑溫?。˙D）和CSCC分別作為早期和晚期惡性腫瘤的代表，然后用免疫組化染色方法比較p53及p16蛋白在BD、CSCC及正常皮膚組織中的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集的50例CSCC和30例BD標(biāo)本，來自2017年1月—2018年1月鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院皮膚科門診或住院部手術(shù)切除的石蠟包埋組織，并經(jīng)病理學(xué)確診。CSCC病理表現(xiàn)為不規(guī)則的鱗狀細(xì)胞浸潤性生長，侵入真皮較深的地方，癌團主要由異型鱗狀細(xì)胞或間變的鱗狀細(xì)胞組成，分化好的可有角珠及角化不良細(xì)胞，分化差的常有較多的不典型核分裂相，無角珠及角化不良細(xì)胞[3]。根據(jù)角化程度又可把腫瘤分為高分化和中低分化，高分化的特點是鱗狀上皮容易辨認(rèn)，且常有明顯的角化，上皮呈清晰的鱗狀，細(xì)胞間橋明顯。中低分化的特點是腫瘤結(jié)構(gòu)紊亂，鱗狀上皮分化不很清晰，核和胞漿顯著多形性，核絲分裂明顯[4]。BD病理表現(xiàn)為表皮全層可見不典型角質(zhì)形成細(xì)胞，見多數(shù)核分裂相，細(xì)胞排列紊亂，有時可見瘤巨細(xì)胞[5]。50例CSCC患者中，男26例，女24例，年齡50～89歲，平均（68.66±9.84）歲；30歲例 BD 患者中，男 13例，女 17例，年齡 35～88歲，平均（47.64±11.45）歲。所有病例均是未經(jīng)激光、放療、化療等抗腫瘤治療的原發(fā)病例。20例正常皮膚組織標(biāo)本來自色素痣手術(shù)切除邊緣正常皮膚。

1.2 主要試劑 鼠抗人p16單克隆抗體和鼠抗人p53單克隆抗體均為即用型抗體，購自中山金橋公司產(chǎn)品，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗為阿斯本生物公司提供。

1.3 實驗步驟 采用免疫組化SP法，嚴(yán)格按說明書操作。用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗做陰性對照，用已知陽性切片做陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷 由陽性細(xì)胞數(shù)量百分比和顯色程度2項指標(biāo)來判定結(jié)果，具體如下：陽性細(xì)胞數(shù)量在觀察的同類細(xì)胞中所占比例，分為5類：陰性為0分；陽性細(xì)胞數(shù)≤10%，1分；11%～50%，2分；51%～75%，3分；＞75%，4分。顯色程度判斷陽性強度，分為4級：無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。最終結(jié)果由兩類計分分值的乘積表示：分?jǐn)?shù)≥4分為陽性，＜4分為陰性[6]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)表示，進行卡方檢驗，不符合條件者采用Fisher檢驗，二者相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p53蛋白染色陽性細(xì)胞特點 p53蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞核，陽性著色呈淡黃色至棕褐色。正常皮膚組織，p53染色多為陰性，陽性細(xì)胞主要散在分布于表皮及皮脂腺周圍，以弱陽性為主。BD的陽性細(xì)胞，主要集中分布于表皮全層，細(xì)胞染色強度強。CSCC的陽性細(xì)胞，主要分布于癌巢組織內(nèi)，細(xì)胞染色強度較強，見圖1。

2.2 p16蛋白染色陽性細(xì)胞特點 p16蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，陽性著色呈淡黃色至棕褐色。正常皮膚組織染色均為陰性。BD的陽性細(xì)胞，主要集中分布于表皮全層，細(xì)胞染色強度強。CSCC，p16染色多為陰性，若陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布于癌巢周圍，中央染色較弱，見圖2。

2.3 p53與p16蛋白在CSCC及BD中染色情況的比較 p53與p16存在4種不同表達(dá)模式：p53-/p16-、p53-/Pp16+、p53+/p16-、p53+/p16+。30 例 BD中，p53-/p16-12 例，p53-/p16+7 例，p53+/p16-2例，p53+/p16+9例。50例CSCC中，p53-/p16-3例，p53-/p16+7例，p53+/p16-36例，p53+/p16+4例，見圖 3、4。

圖1 p53免疫組化染色

圖2 p16免疫組化染色

圖3 BD p53-/p16+表達(dá)模式

2.4 正常皮膚組織、BD及CSCC中p53蛋白的表達(dá)情況 p53蛋白在正常皮膚組織、BD及CSCC中表達(dá)的陽性率分別10.00%、36.67%及80.00%，p53蛋白在高分化鱗癌和中低分化鱗癌中表達(dá)的陽性率分別為 76.67%和 85.00%，p53蛋白在 BD和CSCC中表達(dá)陽性率均高于正常皮膚組織（P＜0.05）。p53蛋白在BD中表達(dá)陽性率低于CSCC，二者間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。p53蛋白在BD、高分化鱗癌及中低分化鱗癌中的表達(dá)率呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見表 1、2。

2.5 正常皮膚組織、BD及CSCC中p16蛋白的表達(dá)情況 p16蛋白在正常皮膚組織、BD及CSCC中表達(dá)的陽性率分別為0.00%、53.33%及22.00%，在高分化鱗癌和中低分化鱗癌中表達(dá)的陽性率分別為30%和10%。p16蛋白在BD和CSCC中表達(dá)陽性率均高于正常皮膚組織（P＜0.05）。p16蛋白在BD中表達(dá)陽性率高于CSCC，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。p16蛋白在BD、高分化鱗癌、中低分化鱗癌中的表達(dá)陽性率呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3、4。

2.6 BD中p53和p16蛋白表達(dá)之間的關(guān)系 30例BD 中，p53-/p16-12例，p53-/p16+7例，p53+/p16-2例，p53+/p16+9例，采用Spearman秩相關(guān)分析，rs=0.402，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示BD中p53和p16蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)性，見表5。

2.7 CSCC中p53和p16蛋白表達(dá)之間的關(guān)系 50例CSCC中，p53-/p16-3例，p53-/p16+7例，p53+/p16-36例，p53+/p16+4例，采用Spearman秩相關(guān)分析，rs=-0.579，P＜0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示 CSCC中p53和p16蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，見表6。

圖4 CSCC p53/p16表達(dá)模式（免疫組化染色）

表1 正常皮膚組織、BD及CSCC中p53的表達(dá) 例

表2 BD及高、中低分化CSCC中p53的表達(dá) 例

表3 正常皮膚組織、BD及CSCC中p16的表達(dá)

表4 BD及高、中低分化CSCC中p16的表達(dá) 例

表5 BD中p53和p16蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

表6 CSCC中p53和p16蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

CSCC是僅次于基底細(xì)胞癌第2常見的皮膚惡性腫瘤，而其發(fā)生轉(zhuǎn)移及死亡的風(fēng)險遠(yuǎn)高于基底細(xì)胞癌[7]。BD是一種表皮內(nèi)CSCC，故又稱為原位CSCC癌，其臨床與病理學(xué)特征類似于CSCC。本病進展緩慢，絕大多數(shù)終生保持其原位癌狀態(tài)，據(jù)報道約有3%～5%演變成侵襲性CSCC[8-9]。CSCC的發(fā)生、發(fā)展是一個極其復(fù)雜的過程，多個基因和多種分子水平共同作用的結(jié)果。原癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的一個重要事件。p53基因突變失活發(fā)生于50%～90%的人類惡性腫瘤包括皮膚癌。同時p16基因的失活（缺失、突變或甲基化）在人類大多數(shù)腫瘤中也被觀察到[10]。本文比較了p53和p16蛋白在CSCC及BD中表達(dá)的差異性，并探討了二者在CSCC及BD中的關(guān)系。

p53腫瘤抑制蛋白是細(xì)胞周期調(diào)控機制的重要轉(zhuǎn)錄因子，p53基因在維持人類基因組完整性方面的關(guān)鍵作用是顯而易見的，因為p53基因是人類癌癥中最常見的突變基因，其失活被認(rèn)為是人類癌癥發(fā)生的關(guān)鍵事件。在正常組織中，p53基因能夠快速修復(fù)紫外線和致癌刺激物損傷的DNA。p53基因的突變導(dǎo)致p53功能的喪失，損傷的細(xì)胞積累、遺傳，并表現(xiàn)出明顯的遺傳不穩(wěn)定性，最終可發(fā)展為惡性腫瘤[11]。在人角質(zhì)形成細(xì)胞中，正常功能的p53基因保護其不受紫外線輻射引起的基因毒性損傷。p53基因的突變可能會破壞p53的功能，允許由紫外線引起DNA受損的突變細(xì)胞積累，這導(dǎo)致p53突變的角質(zhì)形成細(xì)胞克隆性增生，從而可以積累多個突變。因此，這種克隆性增生被認(rèn)為是表皮癌變發(fā)生的關(guān)鍵步驟[12]。p53一直是皮膚癌發(fā)病機制研究一個熱點問題，多數(shù)研究表明p53在CSCC中的表達(dá)是升高的，特別是曝光部位CSCC。2003年Blokx等[13]關(guān)于腎移植和免疫功能正常表皮癌中p53和p16表達(dá)的研究中報道，p53在CSCC中的表達(dá)與腫瘤分級相關(guān)，隨著腫瘤分級的下降而增加。2007年Barzilai等[14]研究發(fā)現(xiàn)p53在日光性角化病、CSCC（日光暴露部位）中高表達(dá)，而在正常皮膚、日光性彈力組織變性及CSCC（非日光暴露部位）中低表達(dá)，但在CSCC中的表達(dá)與腫瘤的分化程度無關(guān)。類似的研究還有，2004年Hussein等[15]研究認(rèn)為p53在正常皮膚、非腫瘤、癌前病變及皮膚腫瘤（包括原位癌及浸潤性CSCC）中的表達(dá)呈逐漸上升趨勢。2016年Bedir等[7]還研究了p53與p16在高分化CSCC及角化棘皮瘤中二者表達(dá)的情況，p53與p16在高分化CSCC中的表達(dá)均高于角化棘皮瘤。本文的實驗結(jié)果顯示p53蛋白在BD和CSCC中的表達(dá)均高于正常皮膚，p53蛋白在CSCC中高表達(dá)，且隨著腫瘤分化程度的下降而增加。本實驗結(jié)果與大多數(shù)研究基本一致。本研究提示p53在BD和CSCC中過度表達(dá)或上調(diào)，且其表達(dá)水平與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，即腫瘤分化越差，表達(dá)越高。從而表明p53的高表達(dá)可能在BD及CSCC的發(fā)生、發(fā)展及浸潤中發(fā)揮著重要的作用。

p16 是由 INK4a（也稱為 MTSI，CDK4I，或CDKN2）基因在9p21染色體上編碼的一種腫瘤抑制蛋白，通過抑制D型周期素依賴性激酶4和6，參與調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因（Rb）活性而起作用。p16CDK4/6復(fù)合物的形成使Rb能夠抑制細(xì)胞周期，而復(fù)合物的形成失敗使細(xì)胞分裂得以繼續(xù)。因此，p16功能或結(jié)構(gòu)喪失可能導(dǎo)致潛在受損的細(xì)胞繼續(xù)增殖和腫瘤發(fā)展的風(fēng)險。p16蛋白在人角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)是在低、高劑量的中波紫外線B（UVB）照射下誘導(dǎo)的。這也許可以解釋為什么過度暴露在陽光下是一個風(fēng)險因素，如脂溢性角化病、光化性角化病和CSCC，已被免疫組織化學(xué)證實了p16的表達(dá)增加[16]。近些年研究表明p16高表達(dá)是HPV相關(guān)性宮頸癌的生物標(biāo)記物[17]。2006年Willman等[18]發(fā)現(xiàn)p16在BD中高表達(dá)。2010年Langendijk等[19]也發(fā)現(xiàn)p16在人頭頸CSCC中高表達(dá)。2016年Marinescu等[10]研究結(jié)果顯示p16在CSCC及BD中的表達(dá)明顯高于上皮內(nèi)瘤變，且p16表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，而與腫瘤分化程度無關(guān)。然而文獻(xiàn)中p16的表達(dá)是有爭議的。2002年Hodges等[20]研究結(jié)果表明大多數(shù)日光性角化癥及BD均表達(dá)p16，但僅有30% CSCC表達(dá)p16。2003年Salama等[21]發(fā)現(xiàn)p16在BD中高表達(dá)，而在日光性角化癥的表達(dá)很少，在CSCC的表達(dá)為陰性。2007年Burnwortha等[1]研究結(jié)果表明p16在日光性角化癥中高表達(dá)，而在CSCC中低表達(dá)或缺失。2016年Supsavhad等[22]報道p16在貓口腔CSCC中低表達(dá)，而不同于人類頭頸CSCC。2006年Conscience等[23]認(rèn)為p16表達(dá)與皮膚腫瘤的組織學(xué)類型無關(guān)，而與是否發(fā)生在曝光部位有關(guān)，日光暴露部位的皮膚癌過表達(dá)（68%），非日光暴露部位皮膚癌低表達(dá)（23%）。本實驗結(jié)果顯示p16蛋白在BD和CSCC中的表達(dá)均高于正常皮膚，但p16在CSCC的表達(dá)（22%）比BD的表達(dá)（53.33%）低，且隨著腫瘤分化程度的下降而減少。本實驗結(jié)果中CSCC的p16表達(dá)較低，可能與Conscience等[23]研究的皮膚癌發(fā)生在非曝光部位有關(guān)，其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)，與Marinescu等[10]的研究不一致，可能是因為本實驗未對皮膚癌進行分期，且分級不夠詳細(xì)。本研究提示p16在CSCC中低表達(dá)或下調(diào)，且其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)，即腫瘤分化越差，表達(dá)越低。從而表明p16的低表達(dá)可能對CSCC的進展有重要意義。

本實驗還研究了p53及p16在BD和CSCC中表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示p53及p16在BD中表達(dá)均上調(diào)，二者在BD中的表達(dá)呈正相關(guān)性（rs=0.402，P＜0.05）；p53在 CSCC 中表達(dá)上調(diào)，p16在 CSCC 中表達(dá)下調(diào)，二者在CSCC的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（rs=-0.579，P＜0.001）。在正常皮膚中，p53能夠快速修復(fù)紫外線和致癌刺激物損傷的基因，p16通過抑制周期素依賴性激酶參與抑制細(xì)胞周期，故能抑制腫瘤的發(fā)生。p53基因突變及p16功能喪失可導(dǎo)致皮膚腫瘤的發(fā)生。在BD中，二者的表達(dá)呈現(xiàn)均質(zhì)性，發(fā)揮共同的作用。在CSCC中，二者的表達(dá)呈現(xiàn)異質(zhì)性，而據(jù)文獻(xiàn)報道p16在皮膚癌中的表達(dá)差異性較大，可能還有其他機制參與，但其具體機制尚不明確。Blokx等[13]關(guān)于p53和p16在腎移植和免疫功能正常表皮癌中的研究顯示，p53及p16在皮膚癌的發(fā)生中呈均質(zhì)性。本文實驗結(jié)果與Blokx等[13]結(jié)果不一致。有待進一步研究。

綜述所述，p53及p16的高表達(dá)可能在BD的發(fā)生中起重要作用，且p53的高表達(dá)可能在CSCC的發(fā)生、發(fā)展及浸潤中同樣發(fā)揮著重要作用，p16的低表達(dá)可能對CSCC的進展有重要意義。但在CSCC中，p16的表達(dá)尚存在爭議，其表達(dá)的高低可能與皮膚癌是否發(fā)生在曝光部位有關(guān)，有待進一步研究。