四聚乙醛對中華絨螯蟹的急性毒性研究

金偉 郭見多 朱磊 馬曉荷 汪敏 張世清

目前化學滅螺的主要藥物為氯硝柳胺，但氯硝柳胺對兩棲動物和魚類等非靶生物有較大毒性，研究表明，氯硝柳胺在濃度為0.2 mg/L時就可以導(dǎo)致兩棲動物的死亡；其對魚類的致死閾值濃度則為0.04～1.00 mg/L[1]。隨著我省血防工作的不斷推進，滅螺工作與水產(chǎn)養(yǎng)殖的矛盾、滅螺與野生動物保護之間的矛盾正在逐步加劇，需要尋找一種同時兼具殺螺效果高和對魚類及兩棲動物低毒性的殺螺藥。

四聚乙醛是一種軟體動物(蝸牛、蛞蝓、福壽螺等)的殺滅劑，具有殺滅效果好、見效快、使用方便及很強的引誘性等優(yōu)點[2]，其殺滅釘螺的作用機制主要是使釘螺體內(nèi)乙酰膽堿酯酶大量釋放，造成神經(jīng)麻痹致死，同時影響釘螺肌細胞的節(jié)律、頻率和幅度，能抑制釘螺上爬。文獻報道四聚乙醛對魚類等水生動物的毒性小，適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)和養(yǎng)殖水域殺滅螺[3，4]。但既往研究中關(guān)于四聚乙醛對中華絨螯蟹(大閘蟹)的急性毒性情況，包括致死濃度閾值等具體指標少有提及。由于缺少相關(guān)資料支持，導(dǎo)致實際工作中使用四聚乙醛在水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)或水域開展滅螺時依舊受到掣肘，本研究針對四聚乙醛對中華絨螯蟹的急性毒性進行實驗研究。

材料與方法

一、試驗材料

1.生物試材

在安徽省當涂縣湖陽鎮(zhèn)選取體重4.5～6.0 g的雌性大閘蟹幼蟹共200只備用。試驗前適應(yīng)性馴養(yǎng)7～14 d，馴養(yǎng)期間每天喂食1～2次，每日光照12～16 h，及時清除糞便及食物殘渣。試驗前24 h停止喂食。

2.試驗藥劑

試驗所用40%四聚乙醛懸浮劑為瑞士龍沙有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品農(nóng)藥登記號為PD20122132，產(chǎn)品生產(chǎn)批號為20171029。對照所用26%四聚·殺螺胺為江蘇艾津農(nóng)化有限公司，產(chǎn)品農(nóng)藥登記號為WP20110222，產(chǎn)品生產(chǎn)批號為2017021001?？瞻讓φ諡槊撀人?。

二、試驗方法及分組

參照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第12部分：魚類急性毒性試驗》(GB/T 31270.12-2014)，結(jié)合現(xiàn)場滅螺工作中四聚乙醛的具體使用特點以及大閘蟹的生活習性對本次試驗方法進行設(shè)計，具體如下：

1.試驗環(huán)境

在實驗室中保持實驗室溫度為(26±2)℃，相對濕度為65%±5%。試驗中每組使用一個容積為50 L的透明塑料水槽，并保持其中藥液和脫氯水的液體量為20 L。試驗中使用增氧泵持續(xù)對藥液供氧，保持藥液溶解氧不低于空氣飽和值的60%。

2.試驗方法

采用靜態(tài)法進行試驗，試驗期間不更換試驗藥液。

3.試驗分組

預(yù)試驗：按照有效成分濃度分別設(shè)置0.25 mg/L、2.0 mg/L、15 mg/L、100 mg/L四個四聚乙醛試驗組，同時設(shè)置脫氯水作為空白對照組。每組放入5只受試大閘蟹，在試驗開始后30 min觀察一次，之后每隔1 h觀察一次，觀察滿6 h后在第24 h、48 h、72 h和96 h再分別觀察一次。分別記錄每次觀察時各試驗組和對照組的大閘蟹活動情況及是否出現(xiàn)死亡，其中中毒后多次刺激無反應(yīng)的個體可判定為死亡，應(yīng)及時從水中撈出。通過預(yù)試驗確定正式試驗的濃度范圍。

正式試驗：在預(yù)試驗確定的濃度范圍內(nèi)按2倍間距設(shè)置5個濃度組，同時設(shè)一個滅螺藥對照組和一個空白對照組。其中滅螺藥對照組使用40倍現(xiàn)場滅螺劑量也就是有效成分濃度20 mg/L(實際制劑濃度80 mg/L)。每組放入15只受試大閘蟹，試驗觀察時間和觀察方法與預(yù)試驗相同。

4.統(tǒng)計方法：試驗所得數(shù)據(jù)使用Excel 2007軟件錄入計算機，并計算各藥物濃度下的大閘蟹死亡率。利用概率單位線性加權(quán)回歸法，得出死亡率的概率單位(y)與用藥劑量(x)的回歸方程并計算出四聚乙醛對大閘蟹毒性的半數(shù)致死量(LD50)。

結(jié) 果

一、預(yù)試驗

每個劑量組的水槽中加入相應(yīng)各濃度的四聚乙醛藥液各20 L，空白對照組加入20 L脫氯水，之后個放入5只大閘蟹。施藥后觀察96 h，各組大閘蟹死亡情況見表1。

表1 四聚乙醛對中華絨螯蟹急性毒性預(yù)試驗結(jié)果

從預(yù)試驗結(jié)果可以看出，受試大閘蟹在施藥后96 h未出現(xiàn)死亡，各組大閘蟹死亡率均為0。據(jù)此可認為在四聚乙醛有效含量濃度為100 mg/L時，大閘蟹不會出現(xiàn)急性中毒現(xiàn)象。

二、正式試驗

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，確定正式試驗中5個試驗濃度組的有效成分濃度分別為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L和800 mg/L。正式試驗同步設(shè)置一個空白對照組和一個四聚·殺螺胺對照組。各組水槽分別加入相應(yīng)濃度的藥液20 L，空白對照組加入20 L脫氯水。試驗觀察96 h后，各組大閘蟹死亡情況見表2。

正式試驗發(fā)現(xiàn)，當試驗時間達到48h，在100 mg/L和200 mg/L兩個劑量的試驗組中各出現(xiàn)了1只大閘蟹死亡，但隨著藥物作用時間延長至96 h，上述兩個劑量組大閘蟹死亡數(shù)未繼續(xù)增多，此外更高劑量組大閘蟹也未出現(xiàn)死亡。參照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第12部分：魚類急性毒性試驗》(GB/T 31270.12-2014)中有關(guān)標準，受試動物可以存著不超過10%的自然死亡率，結(jié)合本次試驗中大閘蟹死亡率僅有6.7%且未出現(xiàn)隨時間或劑量增加死亡數(shù)增多的現(xiàn)象，可以認為該兩例死亡大閘蟹與藥效毒性無關(guān)，屬于自然死亡。

表2 四聚乙醛對中華絨螯蟹急性毒性正式結(jié)果

本次試驗中，25組實測數(shù)據(jù)中有19組的死亡率為0%，在統(tǒng)計分析中當死亡率為0時相應(yīng)的概率單位(y)趨于-∞。因此，依據(jù)本次試驗設(shè)定劑量不可計算LD50。由于本次試驗中最高劑量已達到800 mg/L，是實際滅螺用量的1 000倍，繼續(xù)加大試驗劑量以計算LD50對實際滅螺工作并無指導(dǎo)意義。因此可以得出結(jié)論，經(jīng)過96h急性毒性試驗，四聚乙醛對大閘蟹無急性毒性。

討 論

一般觀點認為，四聚乙醛殺螺作用較慢，殺螺效果尚不及氯硝柳胺。金偉[5]等通過試驗證實，將殺螺作用時間延長到5天其對釘螺的殺滅效果可與氯硝柳胺相當。倪海宏[6]等在現(xiàn)場試驗中發(fā)現(xiàn)，采用制劑濃度為40%的四聚乙醛進行現(xiàn)場滅螺時，作用時間達到3天即可獲得與氯硝柳胺同等的殺螺效果。因此，可以認為40%四聚乙醛是一種可以在殺螺效果上替代氯硝柳胺的殺釘螺劑。

既往研究表明，四聚乙醛對魚類毒性較低。黃軼昕[3]等在試驗中觀察到四聚乙醛對斑馬魚的最低致死劑量大于150 mg/L；陳春娜[7]等的研究結(jié)果則表明，四聚乙醛對鯽魚的最低致死劑量不低于100 mg/L；朱丹[8]等的研究則表明，40%四聚乙醛對絕大多數(shù)常見水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的有效成分安全劑量大于10 mg/L。由于現(xiàn)場滅螺工作中對四聚乙醛的常用劑量為制劑濃度2～4 mg/L，按照常用的40%懸浮劑型換算，有效成分濃度僅為0.8～1.6 mg/L。因此可以認為四聚乙醛是一種可以較好規(guī)避血防滅螺與水產(chǎn)養(yǎng)殖矛盾的殺螺藥。

安徽省當涂縣湖陽鎮(zhèn)是我省水產(chǎn)養(yǎng)殖與血防滅螺沖突較為嚴重的地區(qū)。當?shù)卮箝l蟹養(yǎng)殖戶多，養(yǎng)殖范圍廣，養(yǎng)殖區(qū)域與有螺地帶重疊范圍廣。本次研究針對我省當涂縣湖陽鎮(zhèn)的具體情況選取當?shù)卮箝l蟹幼苗作為試驗對象，試驗中當四聚乙醛有效成分濃度達到800 mg/L作用時間達到96 h，大閘蟹未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象?？梢哉J為四聚乙醛對我省當涂縣湖陽鎮(zhèn)當?shù)卮箝l蟹無急性毒性。關(guān)于四聚乙醛在大閘蟹體內(nèi)殘留及其對大閘蟹生長的長期影響，本研究未能涉及，尚需做進一步研究。