TREM2基因與中國(guó)福建阿爾茨海默病患者相關(guān)性分析

江斌?畢敏?馬琪林?童綏君

【摘要】 目的：探討TREM2基因與中國(guó)福建阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）患者的關(guān)聯(lián)性。方法：納入中國(guó)福建地區(qū)106例AD患者（AD組）和120例健康對(duì)照者（健康對(duì)照組），提取其外周血白細(xì)胞DNA和RNA，運(yùn)用Sanger測(cè)序方法檢測(cè)TREM2基因R47H變異，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，分析TREM2基因與AD的相關(guān)性。結(jié)果：AD組與健康對(duì)照組TREM2基因R47H變異比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），同時(shí)兩組人群TREM2基因mRNA水平相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：TREM2基因可能與中國(guó)福建AD患者無(wú)明顯相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 阿爾茨海默病; TREM2基因; R47H變異; 中國(guó)福建

Associations between TREM2 Gene and Alzheimer Disease Patients in Fujian Province of China/JIANG Bin，BI Min，MA Qilin，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（24）：-157

【Abstract】 Objective：To clarify the associations between the TREM2 gene and Alzheimer disease（AD）patients in Fujian province of China.Method：We investigated 106 AD patients（AD group）and 120 healthy controls（healthy control group）in Fujian province.DNA and RNA were extracted from peripheral blood leukocytes，the R47H variant in TREM2 gene was detected by Sanger sequencing.Moreover，the level of mRNA was determined by quantitative Real-time PCR，and the correlation between TREM2 gene and AD was analyzed.Result：The genotypic and allelic distributions of R47H variant were not statistically significant different between AD group and the healthy control group（P>0.05）.Meanwhile，the level of mRNA of TREM2 gene was not statistically significant different between two groups（P>0.05）.Conclusion：There is no association between TREM2 gene and AD patients in Fujian province of China.

【Key words】 Alzheimer disease; TREM2 gene; R47H variant; Fujian province of China

First-authors address：First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.24.041

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種以進(jìn)行性不可逆的認(rèn)知功能障礙和行為損害為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，是癡呆最常見(jiàn)的類(lèi)型，隨著疾病的進(jìn)展，患者的社會(huì)能力和工作能力逐漸喪失。目前全世界約有AD患者3 560萬(wàn)人，約占全球總?cè)藬?shù)的1%，預(yù)計(jì)患病人數(shù)至2050年將增加至1.154億人[1]，同時(shí)全世界每年花費(fèi)在AD患者上的經(jīng)濟(jì)費(fèi)用高達(dá)1 830億美元，可見(jiàn)AD對(duì)全人類(lèi)是一個(gè)沉重的負(fù)擔(dān)。根據(jù)有無(wú)家族史，AD分為家族性AD（familial AD，F(xiàn)AD）和散發(fā)性AD（sporadic AD，SAD），其中95%AD患者為SAD，他們的發(fā)病年齡多大于65歲。SAD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前主要認(rèn)為與Aβ在腦中聚集形成神經(jīng)炎性斑和過(guò)度磷酸化的Tau蛋白折疊形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)相關(guān)[2]，這些物質(zhì)的形成導(dǎo)致大腦皮層、杏仁核、海馬和基底前腦等多個(gè)區(qū)域的中樞神經(jīng)元丟失。

既往研究提示基因在AD的發(fā)病和疾病進(jìn)展中起到重要的作用，基因的變異如基因多態(tài)性可以增加AD患病和疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)分析，APOE、BIN1、ABCA7、GLU、CD2AP、TREM2等基因證實(shí)與SAD發(fā)病有關(guān)[3-6]。這些基因主要通過(guò)影響免疫系統(tǒng)、脂代謝和Aβ代謝參與到AD的發(fā)病機(jī)制中。其中髓樣細(xì)胞觸發(fā)性受體-2（triggering receptor experssed on myeloid cells 2，TREM2）基因是近幾年新發(fā)現(xiàn)的AD易感基因，其編碼區(qū)內(nèi)R47H變異（rs75932628-T）可使SAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加3倍左右[7]。在隨后多項(xiàng)高加索AD患者和中國(guó)漢族AD患者大樣本研究中也證實(shí)TREM2基因R47H變異可以顯著增加AD的風(fēng)險(xiǎn)[8-10]。

深入研究TREM2基因可以更好地了解AD的發(fā)病機(jī)制，為藥物的治療提供新的靶點(diǎn)，同時(shí)可以結(jié)合腦脊液、血清生物標(biāo)記物和影像表現(xiàn)，觀察其與AD進(jìn)展的相關(guān)性。本研究擬驗(yàn)證TREM2基因與中國(guó)福建SAD患者是否具有相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究入組患者為2016年8月-2018年10月在廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診就診的SAD患者（AD組），共計(jì)106例，SAD患者臨床評(píng)估均由兩名以上高年資神經(jīng)內(nèi)科專(zhuān)科醫(yī)師進(jìn)行。AD臨床診斷參照《精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》和美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病語(yǔ)言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)滿(mǎn)足隱襲起病，癥狀逐漸進(jìn)展;認(rèn)知損害檢查發(fā)現(xiàn)遺忘、語(yǔ)言障礙、執(zhí)行功能障礙、視空間障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：路易小體癡呆、行為變異性額顳葉癡呆、血管性認(rèn)知障礙、非流利性原發(fā)性進(jìn)行性失語(yǔ)和其他可以導(dǎo)致認(rèn)知障礙的神經(jīng)科并發(fā)癥。同時(shí)筆者在同個(gè)地區(qū)社區(qū)中納入120例健康對(duì)照者（健康對(duì)照組）。每位患者和健康對(duì)照者均進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)檢查、神經(jīng)影像檢查和簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表（MMSE）評(píng)估。本研究通過(guò)廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與者均由本人或代理人簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 外周血白細(xì)胞基因組DNA提取 取受試者外周靜脈血2 mL加入3倍體積1×紅細(xì)胞裂解液靜置15 min，3 000 r/min室溫條件下離心3 min，去除上清。加入2 mL 1×紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，靜置10 min后5 000 r/min在室溫條件下離心3 min。去除上清后，加入200 ?L 1×PBS液重懸細(xì)胞，同時(shí)緩慢加入20 ?L蛋白酶和200 ?L AL液，水浴鍋內(nèi)恒溫56 ℃孵育20 min。再加入200 ?L無(wú)水乙醇，混勻后將EP管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至QIAamp Spin Colum柱內(nèi)，室溫條件下9 000 r/min離心3 min。加入500 ?L AW1液體后，室溫條件下9 000 r/min離心1 min后加入500 ?L AW2液體繼續(xù)靜置，在室溫條件下12 000 r/min離心5 min。打開(kāi)EP管蓋子靜置15 min使EP管內(nèi)的乙醇充分揮發(fā)。加入150?L預(yù)熱的AE液室溫條件下靜置15 min，9 000 r/min離心3 min。EP管內(nèi)收集到的液體即為外周血白細(xì)胞基因組DNA。通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，保證其OD260/280比值在1.8～2.0，做好標(biāo)記后保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.2 外周血白細(xì)胞RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

1.2.2.1 外周血白細(xì)胞RNA提取 在外周血白細(xì)胞內(nèi)加入1 mL RNAiso Plus，轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)。加入200 μL氯仿，上下顛倒使液體充分混勻，在冰上靜置15 min后，4 ℃條件下12 000 r/min離心20 min。吸取液體上層水相至新的EP管內(nèi)，加入500 ?L異丙醇混勻充分，在冰上靜置15 min。4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，在EP管底部可見(jiàn)白色沉淀。去除上清，加入1.5 mL 75%乙醇，上下顛倒清洗白色沉淀。4 ℃條件下7 500 r/min離心5 min，去除上清。室溫干燥30 min，加入20 ?L DEPC水充分溶解白色沉淀，同時(shí)測(cè)量RNA濃度，標(biāo)記后保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.2.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄 使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為：2.0 ?L 5×PrimeScript RT Master Mix試劑+500 ng RNA+ddH2O。逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)條件為37 ℃條件下反應(yīng)15 min，85 ℃條件下反應(yīng)5 s，4 ℃條件下反應(yīng)10 min，反應(yīng)產(chǎn)物保存于-20 ℃條件下。

1.2.3 TREM2基因R47H變異檢測(cè) 本研究采用Sanger測(cè)序方法檢測(cè)TREM2基因R47H變異，引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。實(shí)驗(yàn)步驟包括PCR反應(yīng)、PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序反應(yīng)和酒精純化，具體操作步驟參考文獻(xiàn)[11]。利用Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行判讀，結(jié)果與Ensembel數(shù)據(jù)庫(kù)中人基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 通過(guò)Primer Bank設(shè)計(jì)針對(duì)TREM2基因和GAPDH基因特異性引物，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，具體為10 ?mol/?L

濃度正反向引物各0.4 ?L，cDNA模板250 ng，ROX溶液0.2 ?L，SYBR Premix Ex Taq溶液5 ?L，ddH2O 3 ?L。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃條件下變性30 s，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃條件下反應(yīng)5 s，62 ℃條件下反應(yīng)30 s）。建立溶解曲線，95 ℃條件下反應(yīng)15 s，62 ℃條件下反應(yīng)1 min。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)計(jì)1組空白對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0（SPSS Inc.，USA）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 兩組年齡、性別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;AD組MMSE評(píng)分明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 TREM2基因R47H變異與AD的相關(guān)性 TREM2基因R47H變異在正常對(duì)照組的基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（字2=1.96，P>0.05），同時(shí)R47H變異在AD組的基因頻率分布也符合Hardy-Weinberg平衡（字2=1.65，P>0.05），見(jiàn)表2;兩組TREM2基因R47H變異的基因型及等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。

2.3 兩組TREM2基因mRNA表達(dá)水平比較 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：TREM2基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平在AD組和健康對(duì)照組分別為（1.211±0.05）和（1.108±0.03），兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.609，P>0.05）。

3 討論

自1907年報(bào)道了首例AD患者至今，有超過(guò)數(shù)以?xún)|計(jì)的患者深受其害，其主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能損害，同時(shí)常伴有精神行為的異常，最終導(dǎo)致機(jī)體功能喪失。有研究顯示，淀粉樣前體蛋白基因、早老素1基因和早老素2基因是最主要的早發(fā)型FAD的致病基因[12]。而晚發(fā)型SAD致病機(jī)制仍不清楚，目前考慮年齡增加、家族易感性、糖尿病、高血壓等因素均與其發(fā)病具有一定的相關(guān)性[13]。研究提示SAD發(fā)病可能與多個(gè)易感基因的共同作用有關(guān)，已知載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）ε4等位基因與晚發(fā)型AD發(fā)病確切相關(guān)，它可以明顯增加晚發(fā)型AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[14]。而在2013年Jonsson等[7]學(xué)者通過(guò)基因組測(cè)定分析AD患者和健康人群的基因型差異，發(fā)現(xiàn)TREM2基因R47H變異明顯提高AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)3.4倍。同年另外一個(gè)研究通過(guò)外顯子測(cè)定發(fā)現(xiàn)TREM2基因R47H變異與AD也具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[15]。隨后在德國(guó)、美國(guó)、挪威、荷蘭和加拿大等多個(gè)大規(guī)模AD患者研究中也肯定了TREM2基因R47H變異的致病性，而在中國(guó)漢族AD人群中，研究也得到了同樣的結(jié)果[16]。同時(shí)R47H變異也證實(shí)與其他神經(jīng)變性疾病相關(guān)，文獻(xiàn)[17-18]研究發(fā)現(xiàn)R47H變異與帕金森病發(fā)病相關(guān)。此外有研究發(fā)現(xiàn)R47H變異也是肌萎縮側(cè)索硬化和額顳葉癡呆發(fā)病的危險(xiǎn)因素[19]。TREM2基因上除了R47H變異外，D87N變異也證實(shí)與AD具有關(guān)聯(lián)性。此外有報(bào)道提出Q33X、Y38C和T66M變異與額顳葉癡呆相關(guān)[20]。由此可見(jiàn)TREM2蛋白的功能異常是神經(jīng)退行性疾病的重要危險(xiǎn)因素。

TREM2基因位于染色體6q21上，包含5個(gè)外顯子。它是由230個(gè)氨基酸組成的是一種跨膜糖蛋白，包括1個(gè)信號(hào)肽、1個(gè)IgG結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。TREM2蛋白與配體結(jié)合后向胞內(nèi)傳遞信號(hào)，目前認(rèn)為T(mén)REM2蛋白主要由小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，其在AD發(fā)病機(jī)制中的作用尚不明確。TREM2具有免疫調(diào)節(jié)和吞噬作用，有研究提出減弱TREM2的活性可能通過(guò)增多炎癥反應(yīng)從而引起大腦的損傷，它主要通過(guò)降低TNF-α和IL-6水平調(diào)節(jié)免疫[21-23]。同時(shí)有研究提出TREM2敲低后，小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬凋亡神經(jīng)元的能力明顯下降[24]。

此外TREM2可能也通過(guò)參與Aβ的清除從而導(dǎo)致AD。由APP蛋白通過(guò)β分泌酶和γ分泌酶剪切降解生成的Aβ是AD的發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素，特別是Aβ42能通過(guò)聚集形成寡聚體和纖維模式，最終形成淀粉炎性斑塊。有研究提出過(guò)量表達(dá)TREM2的細(xì)胞中Aβ的清除與TREM2蛋白的表達(dá)水平具有正相關(guān)性。同時(shí)有研究提出TREM2基因變異可以抑制TREM2蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸至高爾基體，使其滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力升高，同時(shí)使其在細(xì)胞膜表達(dá)減少，影響其功能發(fā)揮，這被認(rèn)為是TREM2變異主要的致病因素[25]。此外一系列臨床研究證明可溶性的TREM2（soluble TREM2，sTREM2）與AD的進(jìn)程密切相關(guān)，可能參與調(diào)控AD的發(fā)生和進(jìn)展。既往研究發(fā)現(xiàn)在人體腦脊液中sTREM2水平高于正常人群，考慮sTREM2與AD具有相關(guān)性[26]。但是有研究也發(fā)現(xiàn)sTREM2能夠有效誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其對(duì)淀粉樣斑塊的吞噬和降解功能，從而改善神經(jīng)突觸的可塑性，說(shuō)明sTREM2在AD中可能具有重要的保護(hù)功能[27]。

本研究采用傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序進(jìn)行基因多態(tài)性分析，結(jié)果可靠準(zhǔn)確，同時(shí)檢測(cè)AD患者中TREM2基因mRNA表達(dá)水平，研究結(jié)果提示在中國(guó)福建地區(qū)AD患者發(fā)病與TREM2基因R47H變異無(wú)相關(guān)性，同時(shí)AD患者外周血mRNA水平與正常健康人群相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。筆者考慮這可能與本研究樣本量相對(duì)較小有關(guān)，同時(shí)僅檢測(cè)外周血未進(jìn)行腦脊液檢測(cè)可能也會(huì)導(dǎo)致以上結(jié)果，有條件者應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量同時(shí)收集腦脊液再次進(jìn)行檢測(cè)。本研究?jī)H對(duì)R47H變異進(jìn)行研究，考慮可以制作基因芯片同時(shí)對(duì)Q33X、Y38C、T66M等多個(gè)位于TREM2基因上的變異進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步探討TREM2基因與中國(guó)福建AD患者的關(guān)聯(lián)性。

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（收稿日期：2019-05-20） （本文編輯：程旭然）