不同濃度乙醇提取丹參中12種成分比較研究

孫錦　林力　彭勍　張鵬　任鈞國　劉建勛

摘要：目的 ?建立HPLC同時(shí)測(cè)定丹參中9種水溶性成分和3種脂溶性成分含量的方法，以不同濃度乙醇為代表，探討溶劑極性對(duì)丹參有效成分溶出的影響。方法 ?采用Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長280 nm，進(jìn)樣量10 μL，考察不同濃度乙醇（0%、20%、40%、60%、80%、95%）提取的丹參中12種成分的含量。結(jié)果??在95 min內(nèi)，丹參中12種成分可實(shí)現(xiàn)完全分離，在線性范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系（r>0.998），平均回收率為95.28%～104.97%，RSD<4.58%。不同濃度乙醇對(duì)丹參中12種成分含量影響不同，隨溶劑極性降低，水溶性成分總量呈先升高后降低的趨勢(shì)，脂溶性成分持續(xù)升高。結(jié)論 ?本研究建立的方法專屬性好，靈敏度高，定量準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測(cè)定丹參中9種水溶性成分和3種脂溶性成分的含量。不同濃度乙醇對(duì)丹參中12種指標(biāo)性成分的溶出有很大影響。

關(guān)鍵詞：丹參;乙醇濃度;水溶性成分;脂溶性成分

中圖分類號(hào)：R284.1 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）09-0089-05

Comparative Study on Extraction of 12 Components from Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma?with Different Concentrations of Ethanol

SUN Jin， LIN Li， PENG Qing， ZHANG Peng， REN Junguo， LIU Jianxun

Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica， Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China

????Abstract： Objective?To establish an HPLC method for the simultaneous determination of nine hydrophilic compounds and three lipophilic compounds in Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma; To discuss the effects of solvent polarity difference on the dissolution of active components in Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma represented by different concentrations of ethanol. Methods?The HPLC separation was performed on an Agilent Extend-C18 column （4.6 mm ×?250 mm， 5 μm）， eluted with the mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution. The flow rate was 0.8 mL/min; the column temperature was 25 ℃;?the detection wavelength was 280 nm; the injection volume was?10 μL. The contents of 12 components in Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma extracted from different concentrations of ethanol （0%， 20%， 40%， 60%， 80%， 95%） were investigated.?Results?The complete separation was obtained within 95 minutes for the 12 components. There was a good linear relationship between concentration and peak area in the linear range （r>0.998）. The average recoveries were 95.28%–104.97% and RSD were less than 4.58%. Different concentrations of ethanol had different influence on the contents of 12 components. The total amount of water-soluble components increased first and then decreased with the decrease of the polarity of the solvent， and the fat-soluble component continued to rise. Conclusion?The method has good specificity， high sensitivity and accurate quantitative，?which can be used for simultaneous determination of nine hydrophilic compounds and three lipophilic compounds in Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma， and different concentrations of ethanol have great influence on the dissolution of the 12 components.

????Keywords：?Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma; concentrations of ethanol; water-soluble components; fat-soluble components

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza?Bge.的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰功效^[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，丹參中的活性成分主要包括以酚酸類為主的水溶性成分和以二萜醌類為主的脂溶性成分^[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參中的這兩類成分都具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、防止心肌缺血和心肌梗死、降低心肌耗氧量等作用^[3]。

通過對(duì)丹參水溶性成分和脂溶性成分進(jìn)行測(cè)定來評(píng)價(jià)丹參及其制劑質(zhì)量多有報(bào)道，然而大多局限于以丹酚酸B和丹參酮ⅡA為指標(biāo)性成分^[4-8]，且由于丹酚酸類化合物的不穩(wěn)定性^[9-11]，水溶性成分與脂溶性成分性質(zhì)差異太大，很少有同時(shí)測(cè)定多種水溶性和脂溶性成分的報(bào)道。同時(shí)針對(duì)相同適應(yīng)癥的中藥制劑研究很多，提取工藝也多種多樣^[12-15]，但迄今尚未見溶劑極性差異對(duì)丹參成分溶出影響的報(bào)道。本試驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定丹參9種水溶性成分（丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A和丹酚酸C）和3種脂溶性成分（隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA）的定量分析方法，并以這12種成分為指標(biāo)，探討不同濃度乙醇對(duì)丹參化學(xué)成分溶出量的影響，以期為丹參的質(zhì)量控制及制劑工藝篩選提供參考。

1 ?儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;Agilent Extend-C18色譜柱（4. 6 mm×250 mm，5 μm），美國安捷倫公司;METTLER AE240型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司;KQ-300型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水儀，美國MILLIPORE公司;MIKRO-22R臺(tái)式離心機(jī)，德國Hettich公司;FW177中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司。

對(duì)照品丹參素鈉（批號(hào)110855-201614）、阿魏酸（批號(hào)110773-200611）、原兒茶醛（批號(hào)110810- 2005006）、丹酚酸B（批號(hào)111562-201716）、丹參酮ⅡA（批號(hào)110766-200619），中國食品藥品檢定研究院;對(duì)照品紫草酸（批號(hào)Y30S7H22269）、隱丹參酮（批號(hào)H1208X45502）、丹參酮Ⅰ（批號(hào)P28D8F51847），上海源葉生物科技有限公司;對(duì)照品迷迭香酸（批號(hào)20131204）、丹酚酸C（批號(hào)130413），天津一方科技有限公司;對(duì)照品咖啡酸（批號(hào)2681/18660），上海詩丹德生物技術(shù)有限公司;丹酚酸A，本實(shí)驗(yàn)室自制。除丹酚酸B（純度94.1%）、丹酚酸A（純度92%）外，其余對(duì)照品純度均大于98%。丹參飲片（批號(hào)1711011）購自河北百草康神藥業(yè)有限公司，為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza?Bge.的干燥根及根莖。乙腈、磷酸為色譜純（美國Fisher公司），水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），乙醇為95%醫(yī)用酒精（北京鴻志偉達(dá)工貿(mào)有限公司）。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，10%A;5～25 min，10%A→20%A;25～80 min，20%A→70%A;80～90 min，70%A→90%A）;檢測(cè)波長：280 nm;柱溫：25 ℃;流速：0.8 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

2.2 ?對(duì)照品貯備溶液制備

精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度分別為5.649、0.745、0.798、0.757、1.521、1.678、7.864、2.139、1.010、2.099、0.886、5.281 mg/mL的對(duì)照品貯備溶液，置于4 ℃冰箱避光保存，備用。

2.3 ?供試品溶液制備

取丹參粉末1 g（過65目篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入不同濃度乙醇（0%、20%、40%、60%、80%、95%）40 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）60 min，再稱定質(zhì)量，用溶媒補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.4 ?線性關(guān)系考察

精密量取各對(duì)照品貯備液各100 μL，混勻，制成混合對(duì)照品溶液，依次等比稀釋2、4、8、16、32、64、128倍，制成對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各待測(cè)成分的線性回歸方程和線性范圍，見表1。

2.5 ?方法學(xué)考察

2.5.1 ?精密度試驗(yàn)

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10 μL，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B、丹酚酸A、丹酚酸 C、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的峰面積積分值RSD為0.12%～1.45%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于制備后0、2、4、8、12、16、20、24 h注入色譜儀進(jìn)行分析，計(jì)算各成分峰面積積分值的RSD為0.23%～4.97%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 ?重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份丹參粉末，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液（60%乙醇），按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的平均含量分別為0.77、0.022、0.090、0.025、1.00、2.15、23.28、0.41、0.98、0.72、0.29、1.04 mg/g，RSD為1.07%～4.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 ?加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的丹參粉末6份，每份約0.025 g，置2 mL量瓶中，精密加入含丹參素鈉17.09 μg/mL、原兒茶醛1.44 μg/mL、咖啡酸2.55 μg/mL、阿魏酸0.64 μg/mL、迷迭香酸44.23 μg/mL、紫草酸62.79 μg/mL、丹酚酸B 571.35 μg/mL、丹酚酸A 19.91 μg/mL、丹酚酸C 18.19 μg/mL、隱丹參酮21.83 μg/mL、丹參酮Ⅰ12.64 μg/mL、丹參酮ⅡA 29.82 μg/mL的混合對(duì)照品溶液1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果表明本方法回收率良好。

2.6 ?樣品含量測(cè)定

按“2.3”項(xiàng)下方法制備同一樣品不同濃度乙醇提取的供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，用外標(biāo)法測(cè)定丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的含量。結(jié)果見表3。

2.6.1 ?醇提液中各成分含量比較

同一濃度醇提液中，丹酚酸B含量最高，原兒茶醛和阿魏酸含量最低。總體來看，水溶性成分含量高于脂溶性成分。不同濃度醇提液中各成分含量測(cè)定結(jié)果比較可以看出，丹參素鈉、咖啡酸和丹酚酸C溶出量隨溶劑極性的降低而降低;迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A含量均隨溶劑極性的降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A提取峰值分別出現(xiàn)在20%、40%和60%乙醇附近，醇濃度為20%～80%對(duì)丹酚酸B的溶出量沒有明顯影響;隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA溶出量隨溶劑極性降低而升高，醇濃度為80%與95%沒有明顯差異。結(jié)果見圖2。

2.6.2 ?不同濃度醇提液總水溶性成分、總脂溶性成分含量比較

丹參不同濃度醇提液中，隨溶劑極性降低，水溶性成分總量呈先升高后降低的趨勢(shì)，乙醇濃度為40%時(shí)水溶性成分總量最高，乙醇濃度為95%時(shí)水溶性成分溶出總量明顯減少;脂溶性成分總量一直處于增加狀態(tài)，乙醇濃度為80%與95%沒有明顯差異。見圖3。

3 ?討論

本研究以12種化合物的含量作為考察指標(biāo)，采用單因素法分別考察了不同提取方式（加熱回流法和超聲法）、不同提取溶劑體積（6、10、20、40倍）、不同提取次數(shù)（1、2、3次）和不同提取時(shí)間（45、60、90 min），最終確定丹參樣品的最佳提取方法為用40倍溶劑超聲提取1次，每次60 min，此條件下目標(biāo)成分提取較為完全，提取效率高、重復(fù)性較好。

考慮到待測(cè)成分復(fù)雜，化學(xué)屬性相差較大，為確保在同一檢測(cè)條件下對(duì)所有12種成分都有較好的分離效果，本研究對(duì)不同種類、不同廠家的色譜柱進(jìn)行考察，同時(shí)對(duì)流動(dòng)相、柱溫和流速進(jìn)行優(yōu)化，最終確定采用Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，柱溫25 ℃，在該條件下所得色譜圖的分離效果、峰形等均較好。

本試驗(yàn)以不同濃度乙醇為代表，探討溶劑極性對(duì)丹參化學(xué)成分溶出量的影響，結(jié)果表明，溶劑極性對(duì)丹參各成分溶出有很大影響。整體而言，水溶性成分隨溶劑極性的降低而降低，脂溶性成分隨溶劑極性的降低而升高。乙醇濃度在40%左右對(duì)水溶性成分的提取較充分，80%～95%對(duì)脂溶性成分的提取更充分;醇濃度為60%～80%對(duì)水溶性和脂溶性成分的提取均比較充分。如需提取水溶性成分，可以重點(diǎn)考察乙醇濃度在40%左右時(shí)的工藝;如提取脂溶性成分，因乙醇濃度80%～95%時(shí)提取差異不大，考慮到經(jīng)濟(jì)效益、溶劑循環(huán)利用，可以重點(diǎn)研究醇濃度為80%左右的工藝;而乙醇濃度在60%～80%可同時(shí)兼顧水溶性成分和脂溶性成分。同理，需要某一種或幾種成分時(shí)，可參照此結(jié)果縮小研究范圍，篩選最優(yōu)工藝。

多成分、多靶點(diǎn)的整體作用是中藥發(fā)揮療效的基礎(chǔ)。在優(yōu)選中藥提取工藝的過程中，若只以某一成分的含量為指標(biāo)，則不能反映全方的整體效應(yīng)。此前對(duì)中藥提取工藝的研究常以單一成分或少數(shù)成分含量為指標(biāo)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，存在一定的局限性。《中華人民共和國藥典》分別以丹酚酸B和丹參酮ⅡA為指標(biāo)成分對(duì)丹參中水溶性和脂溶性成分進(jìn)行含量測(cè)定^[1]，導(dǎo)致以往研究常以丹酚酸B或丹參酮ⅡA含量為指標(biāo)來優(yōu)選丹參提取工藝，但丹參中水溶性成分和脂溶性成分眾多，其他成分也有較好的藥理作用，單一指標(biāo)成分的含量不能全面衡量丹參提取工藝的優(yōu)劣，所以應(yīng)對(duì)多成分進(jìn)行控制，從而保證丹參提取物的質(zhì)量和療效。

本研究建立的分析方法可同時(shí)測(cè)定丹參中9種水溶性成分和3種脂溶性成分，保留時(shí)間穩(wěn)定、分離效果好，方法精密度高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可為丹參藥材和制劑工藝的控制方法提供依據(jù);從不同濃度乙醇對(duì)丹參化學(xué)成分溶出量角度進(jìn)行比較分析，可為丹參制劑工藝研究提供參考。

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