灰霉病菌對嘧霉胺的抗性誘導研究

余正軍 范曉培

摘 要：為了獲得蔬菜灰霉病菌對嘧霉胺的抗性突變體，在室內(nèi)通過對親本敏感菌株進行藥劑馴化和紫外線的聯(lián)合誘導，獲得了抗嘧霉胺突變體。結(jié)果表明：在自然條件下很可能產(chǎn)生高抗性的抗嘧霉胺突變體。

關(guān)鍵詞：灰霉病菌;嘧霉胺;藥劑馴化;紫外線誘導;抗性突變體

近年來，由于長期單一使用同一種農(nóng)藥，病蟲害的抗藥性也隨之增強;因此我國的科技工作者對農(nóng)作物的病害防治方面做了大量的研究。在我國引進嘧霉胺防治灰霉病害后，在一段時間內(nèi)極大地提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量，病蟲害也降低到了一個較低的水平。但過了3-4年后，在浙江、江蘇和湖南等地就出現(xiàn)了關(guān)于灰霉病菌對嘧霉胺產(chǎn)生了抗藥性的報道。因此本研究在前期研究結(jié)果基礎(chǔ)之上，在室內(nèi)對灰霉病菌進行了抗性誘導，了解蔬菜灰霉病菌對嘧霉胺的抗性水平，以便采取相應(yīng)的治理對策，延緩嘧霉胺的施用年限。

一、材料與方法

1.試驗材料

（1）材料。供試菌株TG30和YX45由山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)藥學研究人員從蔬菜保護地上分離得到。

供試殺菌劑：96.1%嘧霉胺原藥，由山東雙星農(nóng)藥廠提供。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL

含藥培養(yǎng)基：96.1%嘧霉胺原藥用丙酮配成10?g/mL的母液，然后把母液放在4℃的冰箱中貯藏。使用時以無菌水進行稀釋，以10%藥液量加入融化的PDA培養(yǎng)基中（冷卻至45℃～50℃）充分搖勻，制成含最終所需藥量的PDA平板，

（2）儀器。主要儀器：HD-29型凈化操作臺（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），SPX型智能生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠），DHG-9140型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），高壓蒸汽滅菌鍋（上海審安醫(yī)療器械廠），A205型萬分之一電子天平（德國），微波爐（青島海爾集團）。

2.試驗方法

（1）紫外線誘導。將與相對敏感基線相接近的TG30和YX45作為供試菌株，將其在PDA平板上培養(yǎng)4d后，加入8-10mL無菌水，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，制成懸浮液于到入三角瓶中，用無菌水稀釋，在10×10倍顯微鏡下檢查孢子濃度，以每視野50-60個孢子為宜。用移液槍吸取孢子懸浮液200?L注入PDA平板中，用涂布器均勻涂抹，使孢子分散開，打開蓋放在超凈工作臺內(nèi)，紫外燈下20cm處進行照射，每照射20min后就從菌落邊緣取3塊菌塊，將菌塊轉(zhuǎn)接到新的含藥培養(yǎng)基上，用牛皮紙包好迅速放于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，直至能再含藥平板上生長、形成扇形的突變體。

（2） 藥劑馴化。將供試菌株TG30和YX45在PDA平板上培養(yǎng)3d后，取生長邊緣菌塊移入含嘧霉胺1μg/mL的PDA平板上，25℃下連續(xù)繼代培養(yǎng)進行藥劑馴化，10d作為1代。自每代的菌落邊緣取菌絲塊接入含藥平板上培養(yǎng)，采取相同方法逐步提高藥劑濃度直至獲得能在含500μg/mL嘧霉胺平板上生長的抗性抗性突變菌株，則表明菌株這一繼代培養(yǎng)物已對嘧霉胺產(chǎn)生抗藥性，即得到了抗藥性菌株。

（3）紫外線誘導和藥劑馴化。紫外線誘變參照Bruin等介紹的方法：將嘧霉胺親本敏感菌株TG30和YX45接種于PDA平板上，25℃培養(yǎng)4d后，用打孔器在菌落邊緣打取直徑為4mm的菌塊，洗下孢子制成孢子懸浮液（濃度為8×105個/mL），然后涂在含嘧霉胺亞致死劑量1?g/mL PDA平板上，每平板0.1mL，培養(yǎng)24h后，置于紫外燈（15w，254nm）下照射20min，照射距離為20cm。然后在25℃下黑暗培養(yǎng)10d將幸存菌落轉(zhuǎn)接到含最低抑制劑量嘧霉胺的培養(yǎng)基上，用相同的方法逐步提高藥劑濃度培養(yǎng)，直到獲得抗性突變菌株。半個月后得到在500μg/mL藥劑濃度的培養(yǎng)基上紫外照射20min仍可生長菌株TG30-1、TG30-2、TG30-3、TG30-4、TG30-5、TG30-6、TG30-7、TG30-8。

二、結(jié)果與分析

1.紫外誘導

選取灰霉菌株TG30和YX45作為供試菌株，在室內(nèi)經(jīng)過紫外線照射后，形成一個扇形的突變區(qū)域。由表1可以看出，隨著紫外誘導的時間的不同，灰霉菌株的突變程度也是不同的;紫外線照射的時間在20-40min之間時，TG30的突變頻率是最高的，而隨著照射時間的延長，其突變頻率呈直線下降的趨勢。而YX45在通過照射紫外線照射后，幾乎沒有產(chǎn)生突變體，所以就選取TG30作為供試菌株，而蔬菜灰霉菌株TG30在室內(nèi)產(chǎn)生抗嘧霉胺的突變體的最適宜的時間為20-40min。

2.藥劑馴化

選取灰霉菌株TG30和YX45作為供試菌株，在含嘧霉胺的PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)10代后，灰霉菌株由原來的最低抑制濃度1μg/mL提高到500μg/mL的濃度，則證明對灰霉菌株的藥劑馴化成功。具體過程由圖1：

3.紫外誘導和藥劑馴化

由圖2可以看出，蔬菜灰霉菌株TG30的孢子在萌發(fā)的時候，經(jīng)過紫外線誘變7次后，由起初的嘧霉胺最低抑制劑量1μg/mL，提高到在含500μg/mL嘧霉胺的平板上可繼續(xù)擴展，則說明蔬菜灰霉病菌的敏感菌株在紫外線誘變和藥劑馴化雙重誘導條件下可突變?yōu)閷︵酌拱返目剐跃?。證明抗性誘導成功。

三、小結(jié)與討論

任何一種新農(nóng)藥在被投放到市場之前，都要對其抗藥性的風險進行評估，為蔬菜灰霉病菌對嘧霉胺的抗性風險，本實驗采用在室內(nèi)對蔬菜灰霉病菌進行藥劑馴化、紫外線誘導或者兩者結(jié)合起來進行聯(lián)合誘導。

為了獲得蔬菜灰霉病菌對嘧霉胺的抗性突變體，本實驗在室內(nèi)通過對親本敏感菌株TG30進行藥劑馴化和紫外線的聯(lián)合誘導，獲得了抗嘧霉胺突變體;而藥劑馴化或紫外線對敏感菌株TG30單獨誘導出的抗嘧霉胺突變體的抗性倍數(shù)并不等于聯(lián)合誘導出的抗嘧霉胺突變體的抗性倍數(shù)，由此可以推斷，藥劑自然條件下能否得到合理使用，這對于蔬菜灰霉病菌抗藥性的產(chǎn)生起著非常重要的作用，如果長時間使用一種藥劑防治灰霉病害，就很容易使灰霉病菌對藥劑產(chǎn)生抗藥性，從而導致灰霉病菌對藥劑的敏感程度降低，最終很可能失去其應(yīng)有的防治效果。因此，在實際生產(chǎn)中，應(yīng)該合理使用農(nóng)藥，在藥劑對病原菌產(chǎn)生抗藥性后，應(yīng)改變防治方法，制定合理的防治對策，從而延長藥劑的使用年限，避免病害的大面積發(fā)生。

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