豬苓多糖脂質(zhì)體的制備及表征

韓悅 李早慧 趙欣宇 黃禮祥 范靖琪

摘要：目的：旨在通過薄膜分散法-微孔濾膜擠壓法制備脂質(zhì)體，并對脂質(zhì)體包封率、粒度分布、zeta電位進(jìn)行檢測。方法：主要通過單因素試驗及正交試驗篩選出最佳的制備工藝，且驗證工藝的合理。脂質(zhì)體利用薄膜分散法制備并測定包封率，考察脂質(zhì)體的形態(tài)。結(jié)果：所制備出的豬苓多糖脂質(zhì)體包封率較高，粒徑均勻，顯微鏡下脂質(zhì)體均勻圓整、近球形。

關(guān)鍵詞：豬苓多糖;薄膜分散法;包封率

基金項目：吉林省大學(xué)生科技創(chuàng)新省級，項目號：2018012

中圖分類號： TQ461 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： ?A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.16.038

豬苓已有2000多年藥用歷史，是我國比較常用的菌類藥材，在《神農(nóng)本草經(jīng)》等著作中都體現(xiàn)了其應(yīng)用價值[1]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，從中藥材豬苓中分離出來的豬苓多糖，為植物型的免疫增強(qiáng)劑?？梢杂行У卮龠M(jìn)肝細(xì)胞再生和肝功能恢復(fù)，針對慢性乙型肝炎可促進(jìn)表面抗體的產(chǎn)生，具有顯著的治療效果[2]。目前市面上常見的豬苓多糖劑型為膠囊劑及顆粒劑。這些傳統(tǒng)劑型雖然有一定療效，但在血液中停留時間短，藥效低。

20世紀(jì)70年代首次將脂質(zhì)體作為藥物載體應(yīng)用[3]，脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)使其具有靶向作用，可選擇性地作用于細(xì)胞[4]，并具有低毒性和長效緩釋性，引起了廣大藥劑學(xué)者的關(guān)注與研究[5、6]。

本課題突破傳統(tǒng)的中藥劑型，將豬苓多糖制備成脂質(zhì)體，為治療慢性乙型肝炎提供了新的劑型。其增加了藥物與肝細(xì)胞的親和力，有效提高了豬苓多糖在體內(nèi)的吸收，從而增強(qiáng)治療效果。同時，本課題的研究為脂質(zhì)體的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)，對拓寬豬苓多糖脂質(zhì)體的生產(chǎn)有著重要意義。

1儀器與材料

1.1實驗材料

豬苓多糖，生理鹽水，苯酚，濃硫酸，卵磷脂，膽固醇，無水乙醇，甲醇，氯仿，磷酸鹽緩沖液，微孔濾膜，葡萄糖對照品，蒸餾水。

1.2實驗儀器

紫外分光光度儀，分析天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，離心機(jī)，電子顯微鏡，激光散射粒度儀。

2項目實施方案

2.1載藥脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法-微孔濾膜擠壓法[7～8]，在圓底燒瓶中，將卵磷脂，膽固醇與氯仿、甲醇混合，混合均勻后放置到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)[9]，除去氯仿及甲醇，形成一層薄膜。在磷酸鹽緩沖液中加入適量的豬苓多糖，并倒入圓底燒瓶中，可形成大多層脂質(zhì)體，再通過微孔濾膜即得[10]。

2.2正交試驗篩選出最佳制備工藝

2.2.1單因素試驗 在試驗過程中以包封率作為評價指標(biāo)，通過對比在生產(chǎn)過程中各單因素對制備工藝的影響，從而確定出最佳方案。

制備溫度的選擇：水浴溫度的差異在制備過程中會影響磷脂的溶解以及膜材成膜性，進(jìn)而對脂質(zhì)體的穩(wěn)定性造成一定的影響。在保證其他藥品和試劑用量不變的條件下，將水浴溫度改變，考察包封率在不同制備溫度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的變化程度。當(dāng)40℃制備溫度時，脂質(zhì)體的包封率達(dá)到最大值，繼續(xù)升溫后，磷脂不穩(wěn)定，包封率呈下降趨勢，所以應(yīng)選擇溫度為40℃。

氯仿和甲醇比例的確定：有機(jī)相的選擇是穩(wěn)定脂質(zhì)體溶液制備的關(guān)鍵，比例的變化對脂質(zhì)體包封率會產(chǎn)生影響?？疾炻确潞图状嫉谋壤?∶3、1∶2、1∶1、2∶1對包封率的影響，其比例為2∶1時包封率32.25%最優(yōu)，將氯仿與甲醇的比例設(shè)為2∶1。

卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比的確定：膽固醇對卵磷脂凝聚結(jié)構(gòu)有調(diào)節(jié)作用，隨著質(zhì)量比的比例變化，包封率也會隨之變化。考察包封率在磷脂與膽固醇的比例為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1時變化程度，不同的磷脂與膽固醇的比例對包封率的影響較大，在6∶1比例條件下包封率較高。

藥物與卵磷脂質(zhì)量比的確定：不同的藥脂比例會影響脂質(zhì)體的包封率，試驗中保持其他條件不變，來調(diào)整藥脂比例?？疾觳煌幹葘?∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5對包封率的影響，在1∶10比例下包封率達(dá)到最大值35.64%。

2.2.2正交試驗 考察制劑溫度、氯仿與甲醇比例、磷脂與膽固醇的比例、藥脂比對脂質(zhì)體成型影響較大的因素，選用正交表L9（34）進(jìn)行正交試驗（見表1）。

通過上述正交試驗可知，脂質(zhì)體處方中影響因素從大到小分別是A>C>D>B，選擇的最優(yōu)處方為A2、B3、C1、D3，即本實驗最終選擇制備溫度為40℃，0.2g卵磷脂，0.04g膽固醇，0.02g豬苓多糖，氯仿甲醇比例為2∶1，進(jìn)行脂質(zhì)體的制備（見表3）。

2.2.3驗證試驗 重新制備了三批脂質(zhì)體并根據(jù)上述最佳的配比結(jié)果，進(jìn)行試驗。把測得的包封率與表2試驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行對照，結(jié)果基本一致，表明此工藝穩(wěn)定可行。

2.3載藥脂質(zhì)體包封率的測定

2.3.1空白脂質(zhì)體的制備 采用薄膜分散法-微孔濾膜擠壓法，在圓底燒瓶中，將0.2g卵磷脂，0.04g膽固醇與氯仿、甲醇（比例為2∶1）混合，混合均勻后放置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)，除去氯仿及甲醇，形成一層薄膜。將磷酸鹽緩沖液中倒入圓底燒瓶中，可形成大多層脂質(zhì)體，再通過微孔濾膜即得。

2.3.2 檢測波長的確定 用儀器精密吸取2ml，濃度為50mg/mL的葡萄糖對照品溶液，用水作為空白對照，采用苯酚-硫酸法，在200～800nm的波長處進(jìn)行掃描。另取空白脂質(zhì)體2mL，根據(jù)上述流程操作。最終選擇檢測波長為470nm，此時的波長可以使對照品溶液出現(xiàn)最大吸光度，并對空白脂質(zhì)體無干擾性，減小誤差。

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將葡萄糖對照品配制成濃度0.1mg/mL的對照品溶液。加入不同體積的葡萄糖對照品溶液（0.3mL～1.2mL）于帶塞試管中，加蒸餾水至2mL。利用苯酚-濃硫酸法測定不同體積對照品溶液的吸光度，得到回歸方程為y=0.042x+0.0394，r=0.9998。結(jié)論表明：葡萄糖在4.01μg/ml～13.38μg/ml 有著良好的線性關(guān)系。

2.3.4高速離心法測定包封率 在100mL容量瓶中放入載藥脂質(zhì)體1mL，定容。用空白脂質(zhì)體進(jìn)行空白對照試驗，分別取載藥脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體各1.5mL，采用苯酚-硫酸法，在470nm波長處進(jìn)行吸光度值的測定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算脂質(zhì)體中豬苓多糖的含量。在離心管中加入脂質(zhì)體混懸液2mL，離心速度10000r/min，離心20min。用吸管取上清液1mL，定容，利用苯酚-濃硫酸法測定總多糖含量，計算求得包封率〔（W總-W游_/W脂質(zhì)體×100%〕為（38.37±0.02）%。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2.3.5穩(wěn)定性試驗 將脂質(zhì)體分別放在溫度為4℃以及室溫下（20℃），在4℃時外觀均勻，無沉淀及分層現(xiàn)象;在20℃下放置3個月后時出現(xiàn)分層現(xiàn)象。由上述現(xiàn)象可知：4℃時脂質(zhì)體穩(wěn)定性較好。

2.3.6精密度試驗 取對照品溶液稀釋，共配制5份同樣的稀釋液，在配制后6h內(nèi)測定6次，記錄其吸光度，最終計算出其RSD值為1.6%<2%，說明其在6h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4脂質(zhì)體粒徑及電位的檢測

將脂質(zhì)體放入顯微鏡下觀察，其形態(tài)如圖所示（圖略）。利用激光散射粒度儀進(jìn)行脂質(zhì)體檢測。結(jié)果表明，脂質(zhì)體呈正態(tài)分布，粒徑為（115.6±5）nm，Zeta電位為（-25.8±0.56）mV。

3結(jié)論

豬苓多糖是很有價值的提取成分，在對肝組織病理損傷的治療上有著顯著作用。目前，我國對豬苓多糖的研究和應(yīng)用還應(yīng)該增加廣度和深度，多進(jìn)行開發(fā)利用，其作用可以更好的發(fā)揮。

本課題采用薄膜分散法進(jìn)行豬苓多糖脂質(zhì)體的制備，并對其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。以包封率作為試驗的評價指標(biāo)，采用單因素法進(jìn)行對比各因素對制備工藝環(huán)節(jié)的影響，正交試驗設(shè)計出最佳的制備工藝，對脂質(zhì)體的制備處方進(jìn)一步優(yōu)化。綜上所述：制備溫度為40℃，0.2g卵磷脂，0.04g膽固醇，0.02g豬苓多糖，氯仿甲醇比例為2∶1，驗證試驗證明了工藝的穩(wěn)定性和可行性。試驗最終制備出的脂質(zhì)體稀釋后呈淡藍(lán)色乳光，形態(tài)為球形或類球形。包封率較好，穩(wěn)定性考察良好，適合在4℃條件下存放。

本試驗的結(jié)果可為豬苓多糖的下一步研究提供參考，具有一定的研究及推廣價值。

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作者簡介：韓悅，在讀本科生，研究方向：藥物遞送系統(tǒng)的研究

通訊作者：李早慧，碩士，講師，研究方向：中藥現(xiàn)代給藥系統(tǒng)和中藥新藥的研究。