高效液相色譜-(紫外)氫化物發(fā)生原子熒光光譜法測定南極磷蝦及其制品中6種砷形態(tài)

劉淑晗，張海燕，婁曉祎，孔 聰，汪 宇，史永富，黃宣運，沈曉盛*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院 東海水產研究所，上海 200090)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)因其資源量大，富含蛋白質、不飽和脂肪酸、蝦青素和甲殼素等物質[1-2]，在食品和醫(yī)療保健品行業(yè)具有巨大的發(fā)展前景和潛在價值[3-5]。與此同時，南極磷蝦及其制品的食用安全性越來越受到人們重視。然而，研究發(fā)現南極磷蝦及其制品存在高含量砷的問題[6]，其中南極磷蝦油中總砷含量高達(8.334±0.019) mg/kg[7]。砷的毒性不僅與砷總量有關，而且與其化學形態(tài)密切相關。常見的砷形態(tài)有亞砷酸(As(Ⅲ))、砷酸(As(Ⅴ))、一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)[8]，其中無機砷的毒性遠大于有機砷，且不同形態(tài)砷化合物的毒性大小依次為As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MMA>DMA>AsC>AsB[9-10]。因此，建立一種準確、高效測定南極磷蝦中砷形態(tài)的方法對南極磷蝦的安全性分析及綜合利用具有重要意義。

目前，南極磷蝦中砷形態(tài)的測定方法主要有高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(HPLC-ICP-MS)和高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法(HPLC-HG-AFS)。其中，HPLC-ICP-MS法因靈敏度高近年來在元素分析方面發(fā)展迅速，但儀器價格昂貴成為制約其發(fā)展的因素。例如，Schmidt等[11]和Chen等[12]分別采用HPLC-ICP-MS分離檢測海產品和香菇中的6種砷形態(tài)。王松等[7]采用HPLC-ICP-MS檢測南極磷蝦油中5種砷形態(tài)，發(fā)現AsB、DMA和MMA的含量占南極磷蝦油總砷含量的95.58%。該方法準確性好，精密度高，但前處理采用甲醇-水溶液提取，不適用于高蛋白生物樣品及其它南極磷蝦制品[13]。HPLC-HG-AFS法因運行成本低，操作簡單，靈敏度與HPLC-ICP-MS相當，近年來逐漸被應用于砷形態(tài)分析。郭瑩瑩等[14]采用HPLC-HG-AFS檢測南極磷蝦中總砷和總無機砷的含量，但未對砷形態(tài)進行研究。董喆等[15]采用HPLC-HG-AFS測定砷形態(tài)時發(fā)現，AsB和AsC需在紫外及外加氧化劑條件下才能實現分離檢測。然而，上述方法均不能同時測定不同南極磷蝦制品中6種砷形態(tài)，且前處理方法針對性較強，很難滿足不同基質樣品的分析需求。

本文采用高效液相色譜-(紫外)氫化物發(fā)生原子熒光光譜(HPLC-(UV) HG-AFS)技術，通過優(yōu)化儀器條件和提取方法，建立了一種適用于南極磷蝦及其制品(南極磷蝦粉、南極磷蝦罐頭、南極磷蝦油)中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsB和AsC 6種砷形態(tài)的分離檢測方法，可為南極磷蝦的食用安全性評價提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AFS-922 氫化物發(fā)生原子熒光形態(tài)分析儀、SAP-20形態(tài)分析預處理裝置(北京吉天儀器有限公司)；PRP-X100陰離子交換色譜柱(250 mm×4.1 mm，10 μm，瑞士Hamilton 公司)；SHZ-88A水浴恒溫振蕩器(太倉市實驗設備廠)；ST320 pH計(奧豪斯儀器(常州)有限公司)；16RXⅡ高速冷凍離心機(日本 Hitachi CF公司)；HETO Power Dry LL 1500冷凍干燥機(美國 Thermo公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore 公司)。

標準品：亞砷酸、砷酸、一甲基砷酸、二甲基砷酸、砷甜菜堿、砷膽堿標準溶液的濃度分別為(1.011±0.016) μmol/g、(0.233±0.005) μmol/g、(0.335±0.011) μmol/g、(0.706±0.024) μmol/g、(0.518±0.015) μmol/g和(0.375±0.015) μmol/g，購于中國計量科學研究院；硝酸、鹽酸、磷酸氫二銨、過硫酸鉀、硼氫化鈉、氫氧化鈉，均購于國藥集團化學試劑有限公司，其中硝酸和鹽酸為優(yōu)級純，其余均為分析純。

南極磷蝦于2018年4月采自南極地區(qū)，采捕上岸后立即放入-20 ℃冰箱冷凍，運回實驗室后置于-80 ℃下保存。

南極磷蝦制品包括南極磷蝦粉、南極磷蝦油、南極磷蝦罐頭和南極磷蝦醬罐頭。南極磷蝦粉由南極磷蝦冷凍干燥，粉碎機研磨3 min,過40目篩后于-80 ℃下保存；南極磷蝦油包括南極磷蝦油原液(青島康境海洋生物科技有限公司)和市售南極磷蝦油膠囊，其中南極磷蝦油膠囊A(美國Schiff MegaRed，300 mg)、B(美國 Extra Strength,500 mg)、C(美國 Extra Strength,350 mg)、D(美國Sports Research,1 000 mg)、E(臺灣BHK's,500 mg)分別取其內容物后常溫保存；南極磷蝦罐頭和南極磷蝦醬罐頭(遼寧仁達食品股份有限公司)，常溫保存。

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)、南美白對蝦(Penaei)、刀額新對蝦(Metapenaeusensis)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、日本對蝦(Penaeusjaponicus)均購于上海農貿市場，樣品均取肌肉部分，切碎勻漿后，于-18 ℃下保存。

1.2 標準溶液的配制

用1%硝酸配制As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsB、AsC的質量濃度分別為5.750、1.365、3.969、7.013、7.007、6.962 mg/L的6種砷形態(tài)單標標準儲備液，于4 ℃避光保存。使用前以超純水配制成100 μg/L的混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 酸提取法稱取適量樣品(凍磷蝦及磷蝦罐頭樣品5.00 g，磷蝦粉及磷蝦油樣品0.50 g，精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入20 mL 1%硝酸，混勻，浸泡過夜后于70 ℃水浴提取2 h，冷卻至室溫，加入0.5 mL 3%乙酸，混勻，于4 ℃冰箱放置5 min后，加入20 mL正己烷去脂，以8 000 r/min離心15 min，棄去上層溶液，重復1次，過0.22 μm濾膜后，待測定。

1.3.2 甲酯化法稱取適量樣品(凍磷蝦及磷蝦罐頭樣品5.00 g，磷蝦粉及磷蝦油樣品0.50 g，精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入20 mL 3%硫酸甲醇溶液，60 ℃水浴條件下反應2.5 h，冷卻至室溫后，用氨水調至pH 8.0左右，加入20 mL正己烷萃取出油脂，重復1次，甲醇層旋轉蒸發(fā)去甲醇，然后以超純水定容至20 mL，過0.22 μm濾膜后，待測定。

1.4 液相色譜條件

流動相：As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA采用25 mmol/L 磷酸氫二銨溶液(甲酸調至pH 6.0)，AsB和AsC采用5 mmol/L磷酸氫二銨溶液(氨水調至pH 9.0)；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：100 μL。泵速：50 r/min；載流：7%鹽酸溶液；還原劑：1.5%硼氫化鈉(0.5%氫氧化鈉)溶液；氧化劑(UV系統(tǒng))：1.5% 過硫酸鉀(0.5%氫氧化鈉)溶液。

1.5 原子熒光條件

砷燈總電流：60 mA；負高壓：310 V；載氣(氬氣)流速：300 mL/min；屏蔽氣(氬氣)流速：500 mL/min；原子化器高度：8 mm。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

由于AsB和AsC不能直接與硼氫化鈉反應生成氣態(tài)氫化物，導致采用HPLC-HG-AFS對AsB和AsC進行分析時在常態(tài)流路下不出峰，需在紫外燈照射及加入氧化劑條件下將有機砷AsB和AsC氧化成無機砷才能出峰[16-17]。因此As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA在常態(tài)流路下測定，AsB和AsC在紫外輔助條件下測定。

2.1.1 流動相及濃度的選擇實驗對比了15 mmol/L的磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、磷酸二氫銨-硝酸銨、碳酸銨作為流動相時6種砷形態(tài)的出峰情況。結果表明，以磷酸二氫銨、磷酸二氫銨-硝酸銨和碳酸銨溶液為流動相時AsB和AsC均不出峰，而以磷酸氫二銨溶液為流動相時，6種砷形態(tài)均出峰且無重疊。進一步考察了磷酸氫二銨濃度(5～30 mmol/L)的影響，將其pH調至9.0，分別測定100 μg/L 6種砷形態(tài)的峰面積。結果顯示，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA的熒光值在磷酸氫二銨濃度為25 mmol/L時達到最大，之后熒光值隨著磷酸氫二銨濃度的增加而降低；AsB和AsC的熒光值隨著磷酸氫二銨濃度的增加而降低，當濃度為5 mmol/L時熒光值最大，當濃度大于15 mmol/L時不出峰。這是由于高濃度的流動相可縮短分析時間，但會造成色譜峰重疊，分離度減小[18]。因此，選擇As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA的流動相為25 mmol/L磷酸氫二銨溶液，AsB和AsC的流動相為5 mmol/L磷酸氫二銨溶液(紫外條件)。

圖1 流動相pH值對目標物熒光值的影響Fig.1 Effect of mobile phase pH value on fluorescence value of analyte

2.1.2 流動相pH值的選擇采用上述最佳流動相，在pH 6.0～11.0范圍內考察了流動相pH值的影響(圖1)。由圖1可知，pH 6.0時，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA的熒光值最佳；而AsB和AsC的熒光值分別在流動相pH值為9.0和8.0時達到最大，此后隨著pH值的增加而降低。因此，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA的最佳流動相pH值為6.0，AsB和AsC的最佳流動相pH值為9.0(紫外條件)。

2.1.3 泵速的選擇蠕動泵的流速會影響待測液與還原劑、載流的反應時間，進而影響氫化反應的效率[19]?？疾炝巳鋭颖昧魉?25～70 r/min)的影響，結果顯示，當泵速由25 r/min增至50 r/min時，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA的熒光值均持續(xù)增加達到最高值，泵速繼續(xù)增加時熒光值逐漸降低；AsB和AsC的熒光值在25～70 r/min范圍內呈波動性增加，當泵速為50 r/min時熒光值增幅最大。因此，選擇最佳泵速為50 r/min。

2.1.4 負高壓的選擇檢測器的光電倍增管可將光信號轉變?yōu)殡娦盘?，因此負高壓的變化會直接影響熒光值?？疾炝素摳邏?270～320 V)的影響，結果表明6種砷形態(tài)的熒光值均隨負高壓的增加而增加，但AsB和AsC的熒光值在320 V時略微減小，同時考慮到光電倍增管的使用壽命，實驗選擇最佳負高壓為310 V。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

圖2 6種砷形態(tài)的標準色譜圖Fig.2 Standard chromatograms of six arsenic speciations

參照文獻[15,20]，比較了酸提取法和甲酯化法兩種前處理方法的提取效果，其提取劑分別為1%硝酸和3%硫酸甲醇溶液。結果顯示，采用甲酯化法時As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的回收率均低于酸提取法，其中As(Ⅴ)的回收率僅為30.8%，而酸提取法對6種砷形態(tài)的回收率為71.3%～110%，因此選擇酸提取法。進一步采用酸提取法對比了水浴和超聲波輔助2種方式的效果，結果表明70 ℃水浴時6種砷形態(tài)的回收率為65.3%～120%，70 ℃超聲波輔助時DMA的回收率為53.9%，其余5種砷形態(tài)的回收率為76.0%～109%。綜合考慮，實驗選擇70 ℃水浴酸提取法作為前處理方法。

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線、檢出限與定量下限配制5、10、20、30、50、100 μg/L的砷形態(tài)系列標準混合溶液，在最佳實驗條件下采用本方法進行測定，6種砷形態(tài)的標準色譜圖見圖2。以標準溶液的質量濃度為橫坐標(X，μg/L)，各砷形態(tài)的色譜峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。結果表明，6種砷形態(tài)在5～100 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.999 0。以空白日本對蝦作為樣品基質進行加標實驗，加標水平分別為0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/kg，以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)分別計算得方法的檢出限(LOD)為0.01 mg/kg，定量下限(LOQ)為0.03 mg/kg，結果見表1。本方法的LOD和LOQ均小于GB 5009.11-2014中水產動物的方法LOD(0.03 mg/kg)和LOQ(0.08 mg/kg)[21]。

2.3.2 回收率與相對標準偏差選取日本對蝦(As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA 和AsC含量低于檢出限，AsB含量為0.652 0 mg/kg)作為樣品進行加標回收實驗，加標水平分別為0.01、0.05、0.10 mg/kg，每個加標濃度平行測定6次，計算回收率及相對標準偏差(RSD)。由表1可知，6種砷形態(tài)的平均回收率為89.2%～108%，RSD為3.4%～14%，方法具有良好的精密度和準確度。

表1 6種砷形態(tài)的相關系數(r2)、檢出限、定量下限、加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 1 Correlation coefficients(r2),detection limits,quantitation limits,recoveries and relative standard deviations(RSD) of six arsenic speciations(n=6)

2.4 實際樣品分析

采用本方法對南極磷蝦及其制品和5種市售蝦類樣品進行砷形態(tài)分析，結果見表2。其中，南極磷蝦及其制品中MMA和AsC均未檢出;DMA的含量較低，在南極磷蝦醬罐頭、南極磷蝦油膠囊B和C中也均未檢出;無機砷(As(Ⅲ)和As(Ⅴ))的含量均小于0.5 mg/kg，符合GB 2762-2017對水產品及其制品中砷的限量標準[22]。AsB的檢出含量最高，南極磷蝦、南極磷蝦粉和南極磷蝦罐頭中AsB含量占總砷含量的87.91%～99.84%，南極磷蝦油原液和南極磷蝦油膠囊中AsB含量占總砷含量的51.94%～94.50%，該結果與文獻基本一致[7,20]。市售5種蝦類樣品僅檢出較低含量的AsB，均符合GB 2762-2017的規(guī)定。

表2 實際樣品中砷形態(tài)的測定結果(n=3)Table 2 Determination of arsenic speciations in real samples(n=3) w/(mg·kg-1)

*the results are expressed as mean±standard deviation；**not detected

3 結 論

本研究建立了南極磷蝦及其制品中6種砷形態(tài)的HPLC-(UV)HG-AFS檢測方法，并對樣品前處理和儀器條件進行優(yōu)化。方法學驗證結果顯示，6種砷形態(tài)在5～100 μg/L范圍內線性關系良好(r2>0.999 0)，LOD均為0.01 mg/kg，LOQ均為0.03 mg/kg，加標回收率為89.2%～108%，RSD(n=6)為3.4%～14%。該方法具有前處理操作簡單、適用范圍廣、結果準確度高等優(yōu)點，適用于大批量南極磷蝦及其制品中砷的形態(tài)分析。