基于SSR標(biāo)記的MCID法鑒定中國(guó)自主選育的葡萄品種

魏新科，樊秀彩，王晨，劉崇懷*

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/江蘇省果樹(shù)品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)所，河南鄭州 450009）

葡萄屬于葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis），是多年生落葉木質(zhì)藤本植物[1]，按用途可分為鮮食品種、釀酒品種以及砧木品種等。由于其具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益，在世界范圍內(nèi)有大面積栽培，是占據(jù)重要地位的果樹(shù)之一。葡萄栽培歷史悠久，種類豐富，近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，葡萄育種進(jìn)程加快，品種間基因交流更加頻繁，種類日益繁多。許多葡萄品種在植物學(xué)性狀上非常相似，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)品種鑒定方式難以達(dá)到理想的鑒別效果。生化標(biāo)記容易受環(huán)境、氣候影響，可靠性低[2]。SSR分子標(biāo)記能夠直接顯示出DNA分子水平上的差異，不受環(huán)境等因素的影響，具有多態(tài)性高、共顯性、操作簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、基因鑒定、生物多態(tài)性分析等方面[3-4]。

人們通常利用分子標(biāo)記結(jié)果繪制DNA指紋圖譜，或者通過(guò)軟件生成種質(zhì)指紋圖譜后進(jìn)行聚類分析，繪制聚類樹(shù)狀圖表示種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系，判斷其遺傳距離，但針對(duì)品種鑒定方面提供的信息不夠直觀。為了將DNA指紋轉(zhuǎn)化成區(qū)分不同種質(zhì)的有效信息，張曉瑩等[5]提出了基于DNA標(biāo)記的人工繪制植物品種鑒別圖（Manual Cultivar Identification Diagrm，MCID）方法應(yīng)用于品種鑒定，最先應(yīng)用在葡萄品種鑒定上。MCID法是在利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，分析同一對(duì)引物擴(kuò)增出的不同品種的電泳條帶，條帶相同的分為一組，區(qū)分條帶特殊的品種，標(biāo)記各引物及條帶從而得到不同引物擴(kuò)增出的不同品種的條帶鑒定圖。

MCID法可以將DNA標(biāo)記得到的遺傳信息轉(zhuǎn)換為更加直觀，便于參考的鑒定圖。本研究利用9對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)同一種引物下不同葡萄品種DNA序列長(zhǎng)度的多態(tài)性采用MCID方法對(duì)中國(guó)自主選育的308個(gè)葡萄品種進(jìn)行鑒定。同時(shí)對(duì)這些品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，以期為我國(guó)葡萄品種鑒定、品種保護(hù)提供理論依據(jù)和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料主要來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所國(guó)家葡萄種質(zhì)資源圃和張家港市神園葡萄科技有限公司，共308份葡萄種質(zhì)材料（表1）。于2019年4月取植株頂端的幼嫩葉片，暫存于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，之后液氮凍樣保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 DNA提取和檢測(cè)

表1 308份供試葡萄種質(zhì)資源Table 1 308 grape germplasms resource in this research

續(xù)表1 Continued table 1

使用北京諾貝萊生物科技有限公司生產(chǎn)的提取植物基因組DNA試劑盒，參考說(shuō)明書提取308個(gè)葡萄品種的DNA。利用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)已提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)。將含有DNA條帶的瓊脂糖凝膠放在自動(dòng)成像系統(tǒng)中的紫外光照下觀察并拍照。利用Nano Drop1000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品的濃度、OD260/OD280等參數(shù)，將質(zhì)量較好的DNA樣品稀釋至50 ng/μL，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物選擇及PCR擴(kuò)增

研究參照國(guó)際葡萄品種目錄數(shù)據(jù)庫(kù)（Vitis Internationl Variety Catalogue, VIVC, http://www.vivc.de/）公布的9對(duì)葡萄國(guó)際通用引物進(jìn)行篩選分析，引物序列由通用生物公司合成。各引物序列如下：

采用如下比例的25 μL PCR反應(yīng)體系：12.5 μL的Master Mix，1 μL的DNA模板和9.5 μL的雙蒸水，上下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，50～60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min，結(jié)束后4 ℃保存。

表2 引物序列信息Table 2 Information of primer sequences

1.4 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

SSR-PCR產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后取出膠片用去離子水清洗，之后用0.1%硝酸銀溶液震蕩染色5 min，然后用去離子水漂洗1次，加入1.5% NaOH 500 mL+0.4% 甲醛溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色時(shí)長(zhǎng)視情況而定，至條帶顯示清晰即可，顯色后用去離子水漂洗一次，取出膠片拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用0，1統(tǒng)計(jì)法對(duì)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，區(qū)分不同引物擴(kuò)增出的各品種特異條帶。在電泳圖上選取一個(gè)條帶長(zhǎng)度，將在同一分子量上，有特征條帶的記為1，沒(méi)有條帶的記為0，構(gòu)建0/1矩陣。根據(jù)9對(duì)引物對(duì)308個(gè)葡萄品種的擴(kuò)增結(jié)果所構(gòu)建的0/1矩陣，利用NTSYSpc Version 2.10e軟件計(jì)算兩兩品種間的遺傳相似系數(shù)，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)，利用MEGA 7軟件，采用UPGMA法對(duì)308份葡萄品種資源進(jìn)行聚類分析，后期使用FigTree 1.3對(duì)聚類圖進(jìn)行修飾。

1.6 人工繪制植物品種鑒定圖

得到聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果后，首先選擇任意一對(duì)引物的電泳圖，在電泳圖上選取幾個(gè)清晰的條帶位置，統(tǒng)計(jì)各片段長(zhǎng)度處的條帶多態(tài)性，將在該處有條帶的品種歸為一類，無(wú)條帶的品種歸為另一類。在每一大類中的品種可以繼續(xù)通過(guò)其他引物進(jìn)行區(qū)分，每一大類都可以繼續(xù)分為幾小組，直到所有品種被鑒別區(qū)分出來(lái)。之后，根據(jù)分組的情況，人工繪制植物品種鑒別圖，將每一步用到的引物及多態(tài)性譜帶大小標(biāo)注到樹(shù)形鑒別圖的相應(yīng)位置上[6-8]。人工繪制的植物品種鑒別圖是基于PCR擴(kuò)增后的譜帶形態(tài)統(tǒng)計(jì)出的結(jié)果，以引物作為節(jié)點(diǎn)，以特征譜帶的有無(wú)作為分類的依據(jù)，在每個(gè)節(jié)點(diǎn)后是該引物對(duì)不同品種的區(qū)分結(jié)果，包括區(qū)分出的類別或者是直接區(qū)分出來(lái)的單個(gè)品種[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取結(jié)果

本研究利用植物基因組DNA試劑盒提取葡萄DNA，部分葡萄品種的DNA電泳結(jié)果如圖1，DNA片段較為完整，沒(méi)有發(fā)生明顯的降解，條帶較為清晰，根據(jù)Nano Drop1000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，DNA濃度在48～200 ng/μL，OD260/OD280值在1.85～2.1，大部分品種在1.9～2.0，總體上DNA質(zhì)量較好，純度滿足要求，可以用于后續(xù)的擴(kuò)增、鑒定等工作。

2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

聚丙烯酰胺凝膠電泳與瓊脂糖凝膠電泳相比，可以區(qū)分相差個(gè)位數(shù)堿基的片段，試驗(yàn)結(jié)果更加精確。圖2為其中3對(duì)引物VVS2、VVMD5、VVMD27對(duì)部分品種的擴(kuò)增條帶結(jié)果，大部分條帶清晰可見(jiàn)，靠近兩側(cè)的條帶容易出現(xiàn)傾斜，原因可能是灌膠時(shí)沒(méi)有保持水平或者等待膠凝固時(shí)兩側(cè)的板子夾得不嚴(yán)。

圖1 52個(gè)葡萄品種基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Genomic DNA agarose gel electrophoresis map of 52 grape varieties

圖2 引物VVS2(C)、VVMD5(D)、VVMD27(F)對(duì)部分品種擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 Primer VVS2(C), primer VVMD5(D), primer VVMD27(F) amplification results for some varieties

2.3 308個(gè)葡萄品種遺傳多樣性分析

根據(jù)9對(duì)引物對(duì)308個(gè)葡萄品種的擴(kuò)增結(jié)果所構(gòu)建的0/1矩陣，利用NTSYSpc Version 2.10e軟件計(jì)算兩兩品種間的遺傳相似系數(shù)，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)，利用MEGA 7軟件，采用UPGMA法對(duì)308份葡萄品種資源進(jìn)行聚類分析，后期使用FigTree 1.3對(duì)聚類圖（圖3）進(jìn)行修飾。

聚類結(jié)果表明：308個(gè)葡萄品種共分為9類，其中有4個(gè)大類（A、B、E、F）和5個(gè)小類（C、D、G、H、I）。

A類包含47個(gè)葡萄品種，幾乎全部是鮮食品種，占該組材料的95.7%。A類又可分為兩個(gè)部分。第一部分含有16個(gè)品種，其中主要是江蘇省張家港市神園葡萄科技有限公司培育的，如‘園金香’‘園香妃’‘園紅指’‘園綠指’‘園野香’等13個(gè)鮮食葡萄品種。第二部分31個(gè)品種主要為歐亞種，包括：‘墨玉’‘木納格’‘庫(kù)斯卡奇’3個(gè)新疆地方品種，以及‘鄭美’和‘金田美指’，這兩個(gè)品種的親本之一均為‘美人指’?！浯涿倒濉F妃玫瑰’和‘京紫晶’因都含有‘葡萄園皇后’血緣，因此也被聚合到了一起。

B類中包括40個(gè)品種，全部為鮮食品種。其中，巨峰系品種大多聚在這一類，共占17.5%。例如：‘貴園’‘峰光’‘戶太8號(hào)’‘夕陽(yáng)紅’‘香悅’等。此外，由鄭州果樹(shù)研究所選育的‘鄭葡1號(hào)’‘鄭葡2號(hào)’因親本相同聚在了一起；從‘紫珍香’自交后代中選出的優(yōu)良品種‘沈農(nóng)碩豐’和其親本直接聚在了一起。

E類共有51個(gè)品種。其中包含3個(gè)野生種：‘桑葉葡萄’‘華東葡萄’‘山葡萄’，這3個(gè)種直接聚類在了一起；含有‘玫瑰香’血緣的9個(gè)品種‘京秀’‘早熟玫瑰香’‘大粒玫瑰香’‘艷紅’‘瑪瑙’‘澤玉’‘愛(ài)神玫瑰’‘澤香’‘紅香蕉’聚類在這一組，占該組材料的17.6%。山西果樹(shù)研究所以‘瑰寶’為母本育成的‘晚黑寶’和‘秋紅寶’聚在了一起。

F類包含49個(gè)品種，其中包括22個(gè)中國(guó)地方品種，占該類材料的44.9%。材料中43.1%的地方品種聚集在本類中?！?jī)骸P(guān)口葡萄’‘早亞寶’‘白葡萄’‘無(wú)籽露’‘白老虎眼’‘馬熱子’7個(gè)新疆地方品種聚集在一起。該類中還包括我國(guó)的7個(gè)釀酒品種，如‘北醇’‘北玫’‘熊岳白’‘黑圓珠’等。

C、D、G、H、I五個(gè)小類，各包含21、25、25、24、26個(gè)品種。C類中‘沈530’‘沈529’‘沈551’三個(gè)砧木品種直接聚集在一起；同為歐美種的‘黑香蕉’和‘紅雙味’因親本之一都為‘葡萄園皇后’所以聚在一起。D類中含有1份蘡薁葡萄，即‘多裂葉蘡薁’；‘那布古珠’‘黑破黃’‘木拉格’同為地方品種聚在一起；‘伊犁香葡萄’和‘白沙玉’同為新疆地方品種聚在一起。G類含有兩份刺葡萄，即‘紫秋’和‘刺葡萄940’；‘鄭果25號(hào)’和‘公釀1號(hào)’同為釀酒品種，聚集在一起。該試驗(yàn)中大部分無(wú)核品種，如‘鞏義無(wú)核白’‘無(wú)核翠寶’‘岳紅無(wú)核’‘緊穗無(wú)籽’‘皇家無(wú)核’都聚在H類中。I類中包含9個(gè)地方品種，如‘伊犁葡萄’‘微紅白’‘阿克塔那衣’‘馬奶’‘賽勒可阿依’‘白油亮’等，占該類的34%；‘早霞玫瑰’與‘金田0608’都以‘秋黑’做親本，聚在了一起。

通過(guò)對(duì)308份我國(guó)自主選育的葡萄品種進(jìn)行聚類分析可以看出，歐亞種葡萄與歐美種葡萄沒(méi)有明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明兩者親緣關(guān)系較近。聚類結(jié)果表明同一育種單位培育且遺傳關(guān)系較近的品種大多會(huì)聚集在一起。例如，由鄭州果樹(shù)研究所選育的‘鄭葡1號(hào)’‘鄭葡2號(hào)’因親本相同聚在了一起；由山西果樹(shù)研究所以‘瑰寶’為母本育成的‘晚黑寶’和‘秋紅寶’聚在了一起。不同用途的葡萄品種，大多也會(huì)分類，例如B類全部是鮮食品種，砧木品種大多聚集在C類，釀酒品種多大聚集在F類。由于所選材料品種較多，遺傳背景較為復(fù)雜，部分同一種屬類型的品種未能劃分為同一亞類當(dāng)中，這需要進(jìn)一步研究探討。

近年來(lái)，隨著我國(guó)葡萄育種進(jìn)程的加快，國(guó)內(nèi)品種間以及與國(guó)際品種基因交流頻繁，導(dǎo)致了葡萄遺傳背景變得狹窄，因此拓展育種基礎(chǔ)以及尋找更多的野生資源勢(shì)在必行。本研究應(yīng)用SSR標(biāo)記從分子水平上反映了我國(guó)自主選育的葡萄種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，為我國(guó)葡萄育種研究提供了一定的參考依據(jù)。

圖3 基于SSR標(biāo)記的308份葡萄種質(zhì)聚類分析圖Figure 3 Dendrogram of 308 grape cultivars based on SSR markers

2.4 308個(gè)葡萄品種鑒定分析

應(yīng)用基于SSR分子標(biāo)記的人工繪制植物品種鑒別圖法（MCID）對(duì)中國(guó)自主選育的308個(gè)葡萄品種進(jìn)行鑒定。結(jié)合9對(duì)國(guó)際通用引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖將308個(gè)中國(guó)自育葡萄品種鑒別區(qū)分開(kāi)來(lái)。為了使圖像更加清晰明了，用對(duì)應(yīng)的數(shù)字編號(hào)代替葡萄品種名稱。

圖4 308個(gè)中國(guó)自主選育的葡萄品種CID圖Figure 4 CID of 308 grape varieties independently selected in China

首先依據(jù)引物VrZAG79的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖上長(zhǎng)度為275 bp、260 bp、250 bp的3條條帶將308個(gè)葡萄品種分為8大組，有特征條帶用(+)表示，無(wú)特征性條帶用(-)表示。第一組是275 bp(-)、260 bp(-)和250 bp(-)，共包括30個(gè)品種；第二組是275 bp(+)、260 bp(-)和250 bp(-)，共包括8個(gè)品種，數(shù)目最少；第三組是275 bp(-)、260 bp(+)和250 bp(-)，包括33個(gè)品種；第四組是275 bp(+)、260 bp(-)和250 bp(+)，包括19個(gè)品種；第五組是275 bp(-)、260 bp(-)和250 bp(+)，共包括50個(gè)品種；第六組是275 bp(-)、260 bp(+)和250 bp(+)，包括57個(gè)品種；第七組是275 bp(+)、260 bp(+)和250 bp(-)，共包括72個(gè)品種，品種數(shù)目最多；第八組是275 bp(+)、260 bp(+)和250 bp(+)，共包括39個(gè)品種。

通過(guò)引物VrZAG79將308個(gè)品種分為8組之后，繼續(xù)利用更多的引物分別鑒定8個(gè)組的所有品種。以第8組的39個(gè)品種為例，首先利用引物VVMD27的特征條帶210 bp、195 bp、185 bp可以將39個(gè)品種分為7個(gè)小組，帶型為210 bp(-)、195 bp(-)、185 bp(-)的為8-1組，包括編號(hào)為47、134、246、247、256、281在內(nèi)的共6個(gè)品種；帶型為210 bp(-)、195 bp(+)、185 bp(-)的為8-2組，包括編號(hào)為2、26、27、41、63、64、268在內(nèi)的7個(gè)品種；帶型為210 bp(-)、195 bp(-)、185 bp(+)的為8-3組，只包含223號(hào)品種‘達(dá)拉依’，所以該品種被鑒別出來(lái)；帶型為210 bp(+)、195 bp(+)、185 bp(-)的為8-4組，包括編號(hào)為54、196、300在內(nèi)的3個(gè)品種；帶型為210 bp(-)、195 bp(+)、185 bp(+)的為8-5組，包括編號(hào)為17、104、113、137在內(nèi)的4個(gè)品種；帶型為210 bp(+)、195 bp(-)、185 bp(+)的為8-6組，包括編號(hào)為132、147在內(nèi)的2個(gè)品種；帶型為210 bp(+)、195 bp(+)、185 bp(+)的為8-7組，包括其余的16個(gè)品種。在利用引物VVMD25擴(kuò)增的大小為275 bp、265 bp、255 bp的條帶對(duì)8-1、8-2、8-4、8-5、8-6、8-7進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。8-1組中帶型為275 bp(+)、265 bp(-)、255 bp(-)的247號(hào)品種‘皇家無(wú)核’被鑒別出來(lái)；帶型為275 bp(+)、265 bp(-)、255 bp(+)的256號(hào)品種‘新郁’被鑒別出來(lái)；帶型為275 bp(-)、265 bp(+)、255 bp(-)的134號(hào)品種‘謝克蘭格’被鑒別出來(lái)；帶型為275 bp(-)、265 bp(+)、255 bp(+)的47號(hào)品種‘月光無(wú)核’被鑒別出來(lái)；246、281號(hào)品種被分配到275 bp(+)、265 bp(+)、255 bp(-)帶型中，未能鑒別出來(lái)，記為8-1-1組。之后利用第四對(duì)引物VrZAG62擴(kuò)增的長(zhǎng)度為195 bp、185 bp、175 bp的條帶對(duì)8-1-1組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)246號(hào)品種‘沈農(nóng)金皇后’帶型為195 bp(+)、185 bp(+)、175 bp(-)，281號(hào)品種‘黑指’帶型為195 bp(+)、185 bp(+)、175 bp(-)，成功鑒別出來(lái)。

其他7大組按照此方法依次鑒定，最多利用8對(duì)引物就可以區(qū)分所有品種。最后，根據(jù)所有引物及相應(yīng)譜帶信息繪制我國(guó)自主選育的308個(gè)葡萄品種的MCID鑒定圖（圖4）。MCID圖如同化學(xué)元素周期表用于元素信息查閱一樣直觀清晰，簡(jiǎn)單明了，所獲得的葡萄CID圖譜可以提供鑒別這些品種所需要的引物以及依據(jù)的多態(tài)性譜帶，具有高度的可行性與實(shí)用性。具體使用方法如下：①通過(guò)CID圖譜確定待檢測(cè)品種所需要的引物以及多態(tài)性條帶；②利用篩選的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；③通過(guò)分析待檢測(cè)品種PCR擴(kuò)增的多態(tài)性條帶將其鑒別出來(lái)。例如：區(qū)分‘鄭果5號(hào)’（132）,‘沈陽(yáng)玫瑰’（147）和‘達(dá)拉依’（223）3個(gè)品種時(shí)，首先在MCID上可以看到3個(gè)品種最先分支的引物為VVMD27，多態(tài)性條帶為210 bp、195 bp、185 bp。該引物將3個(gè)品種區(qū)分為兩組，‘達(dá)拉依’帶型為210 bp(-)、195 bp(-)、185 bp(+)直接鑒別出來(lái)?！蜿?yáng)玫瑰’和‘鄭果5號(hào)’帶型相同，都為210 bp(+)、195 bp(-)、185 bp(+)。之后在利用VVMD5引物和260 bp條帶即可將‘鄭果5號(hào)’和‘沈陽(yáng)玫瑰’區(qū)分開(kāi)，這樣3個(gè)品種就全部鑒別出來(lái)。

3 討論與結(jié)論

中國(guó)是世界上葡萄遺傳資源最豐富的起源中心之一，豐富的種質(zhì)資源為葡萄領(lǐng)域研究提供了眾多機(jī)會(huì)，同時(shí)也蘊(yùn)藏了很多的挑戰(zhàn)。隨著葡萄在我國(guó)的種植面積不斷擴(kuò)大和下游產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)葡萄的引種、品種鑒定工作提出了更高更豐富的要求[10]。傳統(tǒng)的品種鑒定方式限制因素太多，越來(lái)越無(wú)法滿足鑒定要求。DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展使這些問(wèn)題迎刃而解；與第一代DNA分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外研究中應(yīng)用廣泛[11]。Lefort等[12]使用SSR分子標(biāo)記，采用11對(duì)SSR引物對(duì)50個(gè)希臘葡萄品種（包括鮮食和釀酒品種）進(jìn)行了品種鑒定和遺傳特性的研究。Riaz等[13]于2008年首次使用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析北美‘麝香葡萄’栽培及雜交品種，研究使用14對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)57個(gè)葡萄品種進(jìn)行鑒定并繪制了指紋圖譜，通過(guò)比較親本和子代的共享等位基因，驗(yàn)證了已發(fā)表品種的育種記錄。2015年Mihaljevi?等[14]分析了克羅地亞和黑山（歐洲東南部）的284個(gè)地方葡萄品種，共使用9對(duì)SSR引物，發(fā)現(xiàn)了25個(gè)之前未曾報(bào)道過(guò)的基因型，并將得到的數(shù)據(jù)與歐洲數(shù)據(jù)庫(kù)以及其他已報(bào)道的相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了一些新的同名異物和同物異名品種。樊秀彩等[15]篩選出7對(duì)能擴(kuò)增出父本特異條帶的引物，用SSR分子標(biāo)記結(jié)合形態(tài)學(xué)分析的方法，對(duì)山葡萄和河岸葡萄種間雜交后代進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，雜交后代中有161株是真雜種，后代中還產(chǎn)生了新條帶，因此認(rèn)為SSR標(biāo)記可有效地對(duì)葡萄屬種間雜種進(jìn)行鑒定，從而創(chuàng)新葡萄種質(zhì)資源。

同DNA指紋圖譜和聚類分析相比，MCID法可以將DNA標(biāo)記得到的遺傳信息轉(zhuǎn)換為更加直觀、更方便參考的鑒定圖，具有很強(qiáng)的操作性和很高的參考價(jià)值。在本研究之前，MCID法已經(jīng)被用于其他園藝植物的鑒定，如基于SSR 標(biāo)記的MCID法鑒定花梅品種[16]和利用基于RAPD標(biāo)記的MCID法鑒定枇杷[17]、蘿卜[18]等，這些研究都表明了MCID法在鑒定品種上的可行性。

本研究利用9對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)同一種引物下不同葡萄品種DNA序列長(zhǎng)度的多態(tài)性來(lái)人工繪制植物品種鑒別圖（MCID）對(duì)中國(guó)自主選育的308個(gè)葡萄品種進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，最多利用8對(duì)引物就可以區(qū)分所有品種，同時(shí)對(duì)這些品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，以期為我國(guó)葡萄品種鑒定、品種保護(hù)提供理論依據(jù)和參考價(jià)值。本研究涉及了我國(guó)自主選育的絕大部分葡萄品種，仍有少量品種沒(méi)有形成準(zhǔn)確可靠的CID圖，將我國(guó)自育品種遺傳信息匯總并制作CID圖可以為我國(guó)育種者提供更加直觀的信息，對(duì)我國(guó)育成具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的世界性優(yōu)良品種有推動(dòng)作用。此外，許多國(guó)外培育的優(yōu)良葡萄品種均可繪制CID圖，將世界范圍內(nèi)的優(yōu)良種質(zhì)整合到一起，建立起一個(gè)以MCID法制成的葡萄品種鑒定信息庫(kù)，使分子標(biāo)記技術(shù)更加有效地服務(wù)于育種工作，更好地利用現(xiàn)有品種資源開(kāi)發(fā)新品種、新品系，同時(shí)還可以應(yīng)用于種質(zhì)資源管理和品種保護(hù)工作中，對(duì)葡萄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展有積極的意義。