微小RNA-208a/208b在急性心肌梗死患者外周血中的變化趨勢(shì)研究

雷斌，陳紅娟

急性心肌梗死（AMI）屬于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑奈＜敝匕Y之一，早診斷、早治療是降低死亡率和致殘率的關(guān)鍵[1]。AMI發(fā)病后1 h內(nèi)被認(rèn)為是“黃金治療期”，若延遲3～4 h，患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加5倍以上[2]。目前臨床上普遍將18導(dǎo)聯(lián)心電圖（ECG）和心肌肌鈣蛋白（cTn）、肌酸激酶等生物標(biāo)志物作為最主要的診斷依據(jù)，但是往往會(huì)出現(xiàn)部分漏診或誤診[3]。例如ECG不足以診斷心肌缺血或壞死，急性心包炎、左心室肥大、應(yīng)激性心肌病等都可能出現(xiàn)ST段改變[4]；另外cTnI、cTnT等分子的變化都具有一定的滯后性，大多數(shù)在發(fā)病后3～6 h才出現(xiàn)明顯升高，從而延誤診斷，不僅如此，與ECG一樣，多數(shù)生物學(xué)分子仍然會(huì)受到心肌損傷、慢性腎臟疾病等影響，從而影響其診斷的特異性[5]。近幾年，隨著基因組學(xué)研究的深入，越來(lái)越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]，并且由于循環(huán)miRNAs具有高度的穩(wěn)定性和特異性，分離、檢測(cè)操作簡(jiǎn)單易行，因此對(duì)于疾病的診斷顯示出其獨(dú)特的臨床優(yōu)勢(shì)。miR-208a和miR-208b同屬于miR-208家族成員，特異性高表達(dá)于心肌細(xì)胞，但是否可用于AMI的早期診斷仍不清楚。因此筆者主要目的在于探討患者血清miR-208a/208b在AMI發(fā)病后隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)，判斷在AMI早期診斷中的潛力?，F(xiàn)研究報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本項(xiàng)研究選取2017年7月至2018年6月期間于發(fā)病后4 h內(nèi)在河南科技大學(xué)第三附屬醫(yī)院（洛陽(yáng)東方醫(yī)院）心內(nèi)科就診的AMI患者69例，其中男性37例，女性32例，年齡49～86歲，平均年齡（67.26±7.85）歲。所有患者均行心電圖、心臟彩超和血液生化檢查確診為AMI。另外選取同時(shí)期在我院進(jìn)行冠狀動(dòng)脈（冠脈）造影檢查、排除冠心病診斷的30例志愿者作為對(duì)照組，包括男性15例和女性15例，年齡為47～85歲，平均年齡為（65.98±8.14）歲。本項(xiàng)研究已獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。該實(shí)驗(yàn)的所有過(guò)程均遵從赫爾辛基宣言原則，并經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在充分告知可能存在的風(fēng)險(xiǎn)后與所有患者簽署了知情同意書(shū)。

1.2 患者納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)二維超聲心動(dòng)圖、18導(dǎo)聯(lián)心電圖、實(shí)驗(yàn)室檢查以及X線胸片檢查等確診為AMI患者；②符合2001年由中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)頒布的《急性心肌梗死診斷和治療指南》[7]的診斷標(biāo)準(zhǔn)：具備心電圖的動(dòng)態(tài)演變，缺血性胸痛臨床病史，血清心肌標(biāo)記物（cTnT和cTnI）水平升高超過(guò)參考值上限99百分位值。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的患者；②出現(xiàn)昏迷、意識(shí)障礙、心源性休克、腦卒中者；③智力低下者；④合并嚴(yán)重肝腎功能衰竭、惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重出血傾向者；⑤合并急慢性感染者。

1.3 研究方法

1.3.1 血液樣本采集 所有患者在發(fā)病后4 h（±15 min）、8 h（±15 min）、12 h（±15 min）、24 h（±30 min）、48 h（±30 min）、72 h（±30 min）、96 h（±30 min）、7 d（±30 min）時(shí)分別采集周靜脈血2 ml和5 ml，置于抗凝管中，一部分進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢查；另一部分加入TRIzol試劑，4℃靜置30 min后，3000 rpm離心15 min，提取血漿總RNA，置于-20℃冰箱備用。

1.3.2 心肌損傷標(biāo)志物檢查 采用SYSMEX BX-4000全自動(dòng)生化分析儀（日本希森美康公司）檢測(cè)cTnI、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、血清肌酐（SCr）。嚴(yán)格按照儀器操作手冊(cè)進(jìn)行操作。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測(cè)外周血miRNAs ①提取總RNA。采用凝膠電泳檢測(cè)RNA分子量；采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。②RNA逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)Taqman? MicroRNA reverse transcription kit和Taqman? MicroRNA assay kit試劑盒（日本Takara公司）說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。將cDNA保存至-20℃保存?zhèn)溆?。③按照三步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以組織cDNA為模板，以β-actin作為內(nèi)參，冰浴中配制20 μl PCR反應(yīng)體系，95℃10 min預(yù)變性，95℃變性10 s，60℃退火30s，72℃延伸45 s，循環(huán)40次，60℃ 5 min循環(huán)。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的資料設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。PCR結(jié)果判斷：根據(jù)使用說(shuō)明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將資料輸入SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)水平比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用chi-square檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析進(jìn)行不同指標(biāo)之間的相關(guān)性檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（ROC）曲線確定各指標(biāo)的診斷價(jià)值。設(shè)定檢測(cè)效能α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMI患者和對(duì)照組志愿者臨床資料及血液生化指標(biāo)比較 比較AMI患者和對(duì)照組志愿者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、TG、TC、LDL-C、HDL-C、SCr等指標(biāo)基本一致，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。另外，兩組受試對(duì)象糖尿病史、高血壓史、血脂代謝異常以及吸煙史基本一致，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組受試者的一般臨床資料以及血液生化指標(biāo)比較

2.2 miR-208a/208b和cTnI相關(guān)性

2.2.1 miR-208a/208b和cTnI變化趨勢(shì) 經(jīng)qRTPCR法檢測(cè)，經(jīng)重復(fù)測(cè)量的方差分析，AMI患者發(fā)病后4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、7d時(shí)血清miR-208a/208b以及cTnI的水平變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而對(duì)照組志愿者血清miR-208a、miR-208b表達(dá)水平和cTnI值分別為（0.01±0.00）、（0.01±0.00）、（15.96±7.57）ng/ml，與對(duì)照組志愿者相比，AMI患者各時(shí)間點(diǎn)血清miR-208a/208b表達(dá)水平以及cTnI值較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 AMI患者血清miR-208a/208b和cTnI水平比較（±s）

表2 AMI患者血清miR-208a/208b和cTnI水平比較（±s）

注：AMI：急性心肌梗死；cTnI：心肌肌鈣蛋白

miRNAs 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 7 d F值 P值miR-208a 7.62±2.5713.41±2.9712.18±5.6810.15±5.748.22±4.803.01±2.012.70±1.951.46±0.8789.7410.000 miR-208b 4.13±3.589.19±3.968.34±4.486.75±2.786.77±2.811.36±1.751.29±1.810.76±0.40131.8920.000 cTnI（ng/ml） 27.51±16.4139.75±15.2049.41±20.1642.18±18.7835.47±17.4335.08±15.6726.96±11.5722.63±11.2417.8250.000

2.2.2 miR-208a/208b和cTnI相關(guān)性 在8h時(shí)血清miR-208a/208b均達(dá)到高峰，而cTnI水平在發(fā)病后12 h時(shí)濃度達(dá)到高峰。以對(duì)照組設(shè)置為1，AMI患者血清miR-208a/208b以及cTnI值與對(duì)照組的比值設(shè)為縱坐標(biāo)（Y-軸），時(shí)間變化作為橫坐標(biāo)（X-軸），繪制濃度-時(shí)間變化曲線（圖1）。

2.3 ROC曲線分析miR-208a/208b對(duì)AMI的診斷價(jià)值 經(jīng)ROC曲線分析，AMI患者發(fā)病后4 h、8 h、12 h、24 h時(shí)miR-208a/208b對(duì)AMI早期聯(lián)合診斷的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.775（95%CI：0.643～0.812）、0.892（95%CI：0.802～0.978）、0.823（95%CI：0.743～0.902）、0.759（95%CI：0.684～0.845），發(fā)病8 h時(shí)，miR-208a/208b的約登指數(shù)最高（表3，圖2）。

圖1 血清miR-208a/208b以及cTnI水平與時(shí)間的關(guān)系曲線

表3 ROC曲線分析結(jié)果

圖2 AMI患者發(fā)病后4 h、8 h、12 h、24 h時(shí)血清miR-208a/208b聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線圖

3 討論

AMI是急診科常見(jiàn)的危急重癥，致死率和致殘率較高[8]，給患者家庭和社會(huì)醫(yī)療增加了極大的負(fù)擔(dān)。目前治療的關(guān)鍵在于早診斷，盡早開(kāi)通梗死血管，進(jìn)行血運(yùn)重建[9]。臨床癥狀、心電圖、心肌酶指標(biāo)的變化是臨床上用于AMI最主要的診斷依據(jù)。但是部分患者臨床胸痛表現(xiàn)不明顯；心電圖的動(dòng)態(tài)演變對(duì)于ST段抬高型心肌梗死尤為重要，但是當(dāng)發(fā)生非ST段抬高型心肌梗死時(shí)，尤其是老年患者，心電圖可顯示出左束支傳導(dǎo)阻滯、心律失常、陳舊性心肌梗死等，造成非結(jié)論性診斷[10]；cTn是目前公認(rèn)的診斷價(jià)值最高的血清心肌酶標(biāo)志物，時(shí)間窗較寬，但是仍然存在敏感性及特異性較低等缺陷[11]。

近幾年，越來(lái)越多的專(zhuān)家和臨床醫(yī)師開(kāi)始關(guān)注miRNAs作為心血管疾病診斷分子的潛力。miRNAs是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的小分子非編碼RNA，對(duì)人類(lèi)1/3以上的基因表達(dá)都有一定的調(diào)控作用。Oliveira-Carvalho等[12]學(xué)者最先發(fā)現(xiàn)miR-208a/208b特異性表達(dá)于心肌細(xì)胞，在心肌梗死患者血清中呈高表達(dá)，并且與心肌細(xì)胞損傷密切相關(guān)。然而醫(yī)學(xué)界關(guān)于miRNAs的研究剛剛起步，大多數(shù)的miRNAs尚處于未知領(lǐng)域。筆者首先采集了AMI患者發(fā)病后4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、7 d時(shí)的血清，采用qRT-PCR法檢測(cè)了miR208a/208b表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AMI患者血清miR208a/208b水平在發(fā)病7 d內(nèi)一直高于非冠心病對(duì)照組人群，并且表現(xiàn)出逐漸升高，到達(dá)峰值后逐漸下降的趨勢(shì)，與cTnI變化趨勢(shì)基本一致；但是不同的是，循環(huán)血清中miR208a/208b水平在發(fā)病8 h時(shí)最高，而cTnI水平在發(fā)病12 h時(shí)達(dá)到峰值。既往Liu等[13]學(xué)者曾報(bào)道AMI患者血清中miR208a/208b表達(dá)水平可升高至1000倍以上，而在病毒性心肌炎、心力衰竭時(shí)，血清miR208a/208b雖然較正常對(duì)照人群有所升高，但是升高倍數(shù)較低，最高不超過(guò)30倍。另外，Adachi等[14]學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，miR-208水平升高是發(fā)生在AMI發(fā)病24 h以前峰值應(yīng)該出現(xiàn)在6～12 h之內(nèi)，是AMI發(fā)病的早期事件。在本項(xiàng)研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，AMI發(fā)病8 h時(shí)，患者血清miR208a/208b水平均達(dá)到最高值，分別是對(duì)照組受試者的1341倍和919倍。這與Corsten和Adachi等學(xué)者的研究結(jié)果基本一致。除此以外，我們還發(fā)現(xiàn)，miR208a/208b變化趨勢(shì)與cTnI類(lèi)似，只是miR208a/208b到達(dá)峰值的時(shí)間較cTnI更早。經(jīng)ROC曲線分析，發(fā)病4 h、8 h、12 h和24 h時(shí)，miR208a/208b聯(lián)合診斷的約登指數(shù)分別為0.44、0.65、0.55、0.43，提示在發(fā)病早期階段miR208a/208b對(duì)AMI的診斷效能更高。

目前，臨床上大多數(shù)學(xué)者研究的重點(diǎn)只是單純討論AMI患者血清中miR-208a/208b表達(dá)的變化，往往忽視了在不同發(fā)病時(shí)間點(diǎn)miR-208a/208b對(duì)AMI的診斷價(jià)值。由于發(fā)病時(shí)間更短（2 h以內(nèi)）即入院確診的病例數(shù)太少，因此在本項(xiàng)研究中，我們選擇納入發(fā)病后4h內(nèi)入院的患者。另外，為了避免其他臨床資料對(duì)結(jié)果的影響，我們選擇了年齡、性別構(gòu)成、TG、TC、LDL-C、HDL-C、SCr、疾病史等指標(biāo)基本一致的受試對(duì)象，提示血清miR-208a/208b可能是AMI早期發(fā)病的潛在特異性標(biāo)志分子。miR-208a/208b屬于miR-208基因簇家族成員，特異性高表達(dá)于損傷的心肌細(xì)胞中，但是在心肌干細(xì)胞或胚胎組織干細(xì)胞中都檢測(cè)不到。通過(guò)上調(diào)β-主要組織相容性復(fù)合體導(dǎo)致心肌重構(gòu)以及纖維化的形成[15]。

綜上所述，miR-208a/208b在AMI發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在AMI患者循環(huán)血中，miR-208a/208b隨時(shí)間變化曲線與cTnI基本一致，具有先升高后逐漸下降的變化趨勢(shì)，但是miR208a/208b到達(dá)峰值的時(shí)間較cTnI更早，在發(fā)病后8 h時(shí)miR208a/208b即達(dá)到峰值，且此時(shí)對(duì)AMI的診斷效能最高，因此miR208a/208b可作為AMI早期敏感、快速診斷的輔助生物標(biāo)志物。