高鈉飲食對內(nèi)皮源性血管活性物質(zhì)水平的影響

王立立，張靜怡，郭藝芳，王超，張倩輝，金雅麗

研究表明，食鹽攝入量與高血壓、腦卒中等心腦血管疾病存在劑量-效應關系。高鈉飲食可通過增加內(nèi)皮細胞上單核細胞粘附數(shù)目等促進動脈粥樣硬化的發(fā)生，導致動脈粥樣硬化性心腦血管疾病[1]。內(nèi)分泌功能是血管內(nèi)皮的重要功能之一，通過合成和釋放血管活性因子（如NO和ET）來調(diào)節(jié)血管功能[2]。本研究通過觀察高鈉飲食下大鼠血漿和心肌組織中內(nèi)皮源性血管活性物質(zhì)濃度，進一步認識高鈉飲食與動脈粥樣硬化性血管疾病的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠84只，10周齡，隨機分為兩組：對照組和高鈉鹽組，每組各42只。兩組飼料相同，自由進食，對照組飲去離子水，高鈉鹽組飲0.9%氯化鈉溶液。適應性飼養(yǎng)2周后開始按上述方案飼養(yǎng)，8周后處死（飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院動物實驗室，實驗起止時間為：2017年3月至2017年10月），開胸暴露心臟抽取心室內(nèi)血液。迅速切取心臟，去除右心室及心臟周圍結(jié)締組織，將左心室分為5份，于-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)涮峤M織RNA。

1.2 實驗方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應（RT-PCR）

1.2.1.1 提取組織總RNA 取心肌組織勻漿后劇烈震蕩混勻并靜置5～10 min后12 000 rpm離心15～20 min，提取上清液，加入等體積異丙醇，混勻，-80℃靜置過夜；4℃離心，12 000 rpm 15 min；移去上清液，剩留白色RNA沉淀；用700 μl 75%乙醇混勻，4℃，12000 rpm離心15 min（加兩次乙醇并叩干）；叩干后RNA沉淀用20 μl 去離子水沉淀，-80℃保存?zhèn)溆茫ǐ@得RNA產(chǎn)物）；進行RNA純度及完整性的鑒定，RNA完整無降解，可用于cDNA的合成。

1.2.1.2 cDNA的合成 向離心管中加入：5×buffer、4×dNTP、Rnasine、Radom primer、MMV、RNA，去離子水補至25 μl，42℃ 50 min，95℃ 5 min，反應結(jié)束生成cDNA。

1.2.1.3 β-actin的合成 向離心管中加入：優(yōu)化體系、隨機引物、cDNA、去離子水；β-actin反應條件：預變性94℃ 5 min，95℃、56℃各30 s（兩步法），反應進行35個循環(huán)，4℃保存。

1.2.1.4 目的基因的合成 向離心管中加入：優(yōu)化體系、引物1、引物2、cDNA、去離子水；eNOS反應條件：預變性94℃ 5 min，95℃、56℃各30 s（兩步法），反應進行35個循環(huán)，4℃保存。

1.2.1.5 產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物15 μl上樣進行電泳分析；紫外光照下對凝膠進行攝影，再用UVP凝膠成像系統(tǒng)進行電泳譜帶分析，以特定性擴增產(chǎn)物eNOS電泳帶峰面積積分值與β-actin電泳帶峰面積積分值之比作為eNOS的相對表達量。

1.2.2 血及組織中NO、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、ET-1的測定 采用硝酸還原酶法進行NO濃度的測定；根據(jù)吸光度不同進行血清eNOS活性的測定；ET-1含量的測定采用過放射免疫法。

1.3 主要試劑和儀器 eNOS：引物1：5-TGCTGCCCGAGATATCTTCDAGT -3’；引物2：5’- GGCTGCCTTTTTCCAGTTGTTC -3’。β-actin：引物1：5’-CCATGTACGTAAGCCATCCA-3’，引物2：5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。以上引物均由上海生物工程有限公司合成。Trizol Reagent（華美生物工程公司）； AMV Reverse Transcriptase、Rasine(MN0042)、Radom primer(C118A)、Taq DNA聚合酶 1 unit、PCR增強劑2mM（Promega公司，美國）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，首先進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布采用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗，以P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。質(zhì)血漿濃度的影響 實驗組SD大鼠經(jīng)過8周的0.9%氯化鈉飼養(yǎng)后，血鈉及ET-1水平顯著性高于對照組（P＜0.05），而NO及其合成酶eNOS顯著性低于對照組（P＜0.05）（表1）。

2.2 高鈉飲食對大鼠心肌組織內(nèi)皮源性血管活性物質(zhì)水平的影響 實驗組SD大鼠經(jīng)過8周0.9%氯化鈉飼養(yǎng)后，心肌組織ET-1水平顯著性高于對照組（P＜0.05），心肌組織NO、eNOS及內(nèi)皮型一氧化氮合酶信使RNA （eNOSmRNA）表達均顯著低于對照組（P＜0.05）（表2）。

表1 兩組血漿鈉及血清NO、eN0S、ET-1結(jié)果比較（±s）

表1 兩組血漿鈉及血清NO、eN0S、ET-1結(jié)果比較（±s）

注： Na+ ：血鈉；NO：一氧化氮；eNOS：內(nèi)皮型一氧化氮合酶；ET-1：內(nèi)皮素-1

項目 實驗組（n=4 2） 對照組（n=4 2） t值 P值N a+（m m o l/L） 1 4 4.0 2 9±9.5 4 2 1 3 9.3 7 5±7.3 2 3 2.5 0 8 0.0 1 4 N O（μ m o l/L） 5 4.0 2 4±1 2.2 0 7 4 6.9 5 2±1 0.4 1 4 2.6 0 2 0.0 1 1 e N O S（m g/L） 6.2 6 5±1.1 8 6 5.6 5 5±1.1 5 6 2.3 8 7 0.0 1 9 E T-1（n g/L） 6 5.8 9 5±1 2.1 0 7 6 0.3 1 7±1 1.2 2 5 2.1 9 0 0.0 3 1

表2 兩組心肌組織NO、eN0S、eNOSmRNA及ET-1結(jié)果比較（±s）

表2 兩組心肌組織NO、eN0S、eNOSmRNA及ET-1結(jié)果比較（±s）

注：NO：一氧化氮；eNOS：內(nèi)皮型一氧化氮合酶；eNOSmRNA：內(nèi)皮型一氧化氮合酶信使RNA；ET-1：內(nèi)皮素-1

項目 實驗組（n=4 2） 對照組（n=4 2） t值 P值N O（μ m o l/L） 0.8 9 7±0.1 8 6 0.8 1 0±0.1 3 3 2.4 6 6 0.0 1 6 e N O S（m g/L） 0.4 0 8±0.1 6 2 0.2 9 6±0.1 2 7 3.5 2 6 0.0 0 1 e N O S m R N A 3 3 1 4.9 2 7±1 1 8 7.9 4 1 2 6 9 8.6 9 6±1 0 8 7.0 3 0 2.4 8 0 0.0 1 5 E T-1（n g/L） 2 3 0.9 6 2±1 3.3 1 4 3 9.4 7 1±1 4.4 8 3 2.8 0 3 0.0 0 6

2 結(jié)果

2.1 高鈉飲食對大鼠血鈉及內(nèi)皮源性血管活性物

3 討論

血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化發(fā)病的始動因素和重要環(huán)節(jié)[3]，多種心血管疾病危險因素（高血壓、糖尿?。┒际峭ㄟ^損傷血管內(nèi)皮，觸發(fā)了動脈粥樣硬化性血管疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，血管內(nèi)皮功能是動脈粥樣硬化早期血管損傷評估的重要指標和防治靶點[4]。血管內(nèi)皮是人體最大的內(nèi)分泌器官，具有多種生理功能。ET是內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的主要縮血管物質(zhì)，在血管內(nèi)皮細胞分布的主要是ET-1。NO是其分泌的內(nèi)源性血管擴張物質(zhì)，是有效的內(nèi)源性抗動脈粥樣硬化因子，可抑制動脈粥樣硬化發(fā)生的關鍵步驟[5]。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制NO產(chǎn)生，減弱內(nèi)皮功能，可加速動脈粥樣硬化發(fā)生[6]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）是血管NO合成最主要的酶，生理情況下eNOS合成和釋放NO。藥物抑制NOS活性或內(nèi)皮NOS基因缺陷的動物模型中，動脈粥樣硬化進程加快；而增加血管NOS活性則減少斑塊形成[7]。因此，通過內(nèi)皮源性血管活性物質(zhì)聯(lián)合危險因素對血管的損傷作用，可更好地了解血管損傷情況，具有很好的臨床應用價值。

越來越多的基礎和臨床研究證據(jù)表明，高鈉飲食升高血鈉，使血管內(nèi)皮功能受損，動脈僵硬度增加，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[8]。本研究入組84只健康成年雄性SD大鼠，隨機分為對照組（飲去離子水）和高鈉鹽組（飲用含0.9%Nacl），每組各42只。適應性飼養(yǎng)2周，實驗飼養(yǎng)8周后處死，分別檢測血漿及心肌組織中ET-1、NO、eNOS及eNOSmRNA濃度或活性，進一步了解高鈉飲食在動脈粥樣硬化中的發(fā)病機制。結(jié)果提示：高鈉飲食組血Na及ET-1水平顯著性高于對照組（P＜0.05），eNOS及NO顯著性低于對照（P＜0.05)；高鈉飲食組心肌組織NO、eNOS及eNOSmRNA顯著性低于對照組（P＜0.05），心肌組織ET-1水平顯著性高于對照組（P＜0.05）。

研究表明，高鈉飲食可增加ET-1的產(chǎn)生[9]。由于內(nèi)皮衍生的ET-1大部分被釋放到細胞基底側(cè)，故其血漿水平并不總是反映生產(chǎn)，也可能是一個顯示清除的指標[10]。同時，各種組織均能夠產(chǎn)生ET-1，研究證實高鹽攝入可增加腎小管細胞以及血管內(nèi)ET-1的生成[11]，此研究進一步證實其可增加心肌組織ET-1的產(chǎn)生。

這一結(jié)果與Cao等研究相呼應，后者給予Dahl鹽敏感大鼠高鈉飲食后，血漿NO水平及eNOS表達明顯降低。該研究發(fā)現(xiàn)高鹽飲食可對蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMT）——非對稱二甲基精氨酸（ADMA）——二甲基精氨酸二甲氨水解酶（DDAH）系統(tǒng)產(chǎn)生影響，獨立于血壓而引起內(nèi)皮功能受損[12]。ADMA是內(nèi)源性NOS抑制劑，被認為是血管內(nèi)皮損傷的重要危險因素，輕度升高即可顯著抑制NO產(chǎn)生。ADMA在PRMT作用下產(chǎn)生，通過DDAH代謝降解，經(jīng)腎臟排出體外。在Dahl鹽敏感大鼠，給予高鈉飲食后血漿NO水平顯著降低，DDAH及eNOS表達、活性亦明顯減少，提示高鈉飲食通過降低DDAH活性使ADMA代謝受損，水平升高，增加eNOS解偶聯(lián)作用從而降低eNOS生物利用度，減少eNOS表達，降低內(nèi)源性NO產(chǎn)生，且以正反饋方式促進氧化應激，進一步加重內(nèi)皮損傷。因此，高鈉飲食通過下調(diào)DDAH活性及eNOS表達降低血漿NO水平[13]。

先前大部分研究以攝入4%、8%、10%氯化鈉鹽水與正常飲食或0.9%氯化鈉鹽水進行比較，觀察高鈉飲食對血壓的影響[14]，本研究以0.9%氯化鈉鹽水作為實驗組，進一步說明0.9%氯化鈉鹽水亦可影響血及心肌組織ET-1、NO、eNOS、eNOSmRNA表達，從而引起動脈粥樣硬化性血管病變及靶器官損害。另外，有研究提示阿托伐他汀+去除高鹽飲食可使大動脈eNOS活性正?；?。提示在鹽敏感性高血壓患者中應用他汀藥物，伴隨著血管eNOS下調(diào)以及氧化應激的抑制可對靶器官起保護作用，這將為臨床治療提供新策略[15]。

高鈉飲食獨立于血壓水平可引起動脈結(jié)構和功能的改變是國內(nèi)外已有的結(jié)論。而本文的新發(fā)現(xiàn)、新見解是進一步從分子生物學角度闡述高鈉飲食可對內(nèi)皮系統(tǒng)產(chǎn)生影響，進而引起動脈粥樣硬化性心腦血管疾病及靶器官損害。