阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞膜電位影響的機(jī)制研究

肖懿慧，李挺，曹瑜夢，高淵

血管平滑肌表達(dá)炎癥因子IL-lα和β的基因，并以自分泌的形式調(diào)控細(xì)胞功能[1]。Shimokawa等用IL-lβ包裹豬冠狀動脈（冠脈）外膜介導(dǎo)冠脈病變的動物模型，證實(shí)冠脈血管收縮反應(yīng)性增高，動脈粥樣硬化斑塊形成[2]。IL-lβ對血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、分化、收縮反應(yīng)性均有影響[3-5]。IL-1β明確影響血管平滑肌膜電位[6]，而細(xì)胞膜電位與血管痙攣、細(xì)胞增生、遷移等多種生物學(xué)表現(xiàn)相關(guān)[5,6]。大電導(dǎo)鈣敏感鉀通道（BKca）是血管平滑肌細(xì)胞的優(yōu)勢鉀通道，是形成血管平滑肌膜電位主要原因[7]。BKca通道敏感于細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平[7,8]，已有報(bào)道，IL-1β通過H2O2影響B(tài)Kca通道活性從而調(diào)節(jié)膜電位[9]。他汀類藥物具有抗炎作用，且明確下調(diào)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平[10,11]，有理由推測，他汀類藥物通過下調(diào)大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞（ASMCs）內(nèi)活性氧簇水平，上調(diào)BKca通道活性，逆轉(zhuǎn)IL-1β對膜電位影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 原代大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞（ATCC），高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清（美國hyclone公司），過氧化氫檢測試劑盒（上海碧云天公司），阿托伐他汀粉劑（美國輝瑞公司），二碘化丙啶（PI），細(xì)胞膜電位熒光指示劑DIBAC4（3），BKca通道特異阻斷劑IBTX（美國sigma公司），倒置顯微鏡（日本尼康公司），激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司），第三方軟件Olympus Fluoview V6.1（日本奧林巴斯公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 對照組、IL-1β處理組、IL-1β+catalase（H2O2清除劑）處理組、阿托伐他汀（atorvastatin）+IL-1β處理組、atorvastatin+IL-1β+catalase處理組；IL-1β濃度為50 ng/ml，與ASMCs共培養(yǎng)時間為12 h；阿托伐他汀濃度為100 μmol/L；catalase濃度為200 U/ml。

1.3 ASMCs細(xì)胞培養(yǎng) 倒去原代細(xì)胞瓶內(nèi)培養(yǎng)液，加入PH7.2的PBS液洗滌3次，加入2.5 g/L的胰蛋白酶1ml消化細(xì)胞，待大鼠ASMCs收縮成球形時加入含200 ml/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基5 ml終止消化。吸管反復(fù)吹打瓶底細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，并移入50 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。3代至6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 ASMCs細(xì)胞活性檢測 流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測ASMCs細(xì)胞活性，收集單細(xì)胞懸液2 ml，約2×106個細(xì)胞。PBS緩沖液洗滌2次，800 ml/L冰乙醇固定并予-20℃冰箱放置約24 h。檢測前PBS緩沖液再次洗滌一次，室溫放置15 min，用磷酸檸檬酸緩沖液再洗滌一次（另一管用Hank’s液洗滌一次作為對照）。均加入PI（100 μg/ml）、Rnase A（5 μg/ml），并加入PBS緩沖液500 μl，暗室放置30 min后上機(jī)測定。

1.5 過氧化氫檢測試劑盒測定各組細(xì)胞內(nèi)H2O2水平 過氧化氫檢測試劑在冰上或冰水浴上融解，檢測孔或檢測管內(nèi)加入50 μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，每個孔內(nèi)加入100 μl過氧化氫檢測試劑，輕輕振蕩或敲打混勻，20～30℃放置30 min后分光光度計(jì)下測定A560，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中過氧化氫的濃度，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值作為最終數(shù)據(jù)。

1.6 ASMCs細(xì)胞膜電位的激光共聚焦顯微鏡檢測 DiBAC4（3）作為測定膜電位的熒光探針，終濃度為5 μmol/L。選擇生長狀態(tài)良好的ASMCs，用含鈣Hank’s液洗去懸浮細(xì)胞。取大鼠ASMCs 400 μl至激光共聚焦顯微鏡專用小皿，每皿加入400 μl的DiBAC4（3）染液，37℃孵育20 min后，保留染液，上機(jī)測定。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察激發(fā)波長為488 nm時膜電位指示劑熒光強(qiáng)度。每個小皿選取3個細(xì)胞測量熒光強(qiáng)度，重復(fù)4次試驗(yàn)，第三方軟件Olympus Fluoview V6.1分析結(jié)果。1.7 BKca單通道活性研究 ①BKca單通道膜片鉗試驗(yàn)細(xì)胞準(zhǔn)備：膜片鉗蓋玻片小塊6塊置于直徑3.5 cm小皿，細(xì)胞傳代時，滴加細(xì)胞懸液4～6滴至小皿。常規(guī)添加高糖DMEM及10%胎牛血清，48 h后倒置顯微鏡下觀察，蓋玻片上細(xì)胞貼壁良好，呈梭形，邊緣銳利者視為成功。細(xì)胞密度以高倍鏡（400倍）下每視野細(xì)胞25個左右為宜。②采用內(nèi)面向外膜片（inside-out patch）技術(shù)記錄單通道電流。鉗制電壓0至+60 mV，方波刺激，步階為10 mV，持續(xù)時間為400 ms；BKCa通道電流驗(yàn)證：BKCa通道單通道電流檢測鉗制電壓至+50 mV，在浴液中加入5 nmol/L 4-AP，封接過G后，引出單通道電流，觀察100 nmoL/L IBTX灌流細(xì)胞后電流圖形變化，驗(yàn)證BKCa通道電流。③單通道檢測指標(biāo)：開放概率NPo。NPo是指在某一指令電壓條件下，箝制膜片上所有通道總的開放概率，其中N：膜片上通道的數(shù)目；Po：指令電壓條件下，刺激時間內(nèi)，正在開放的單個通道的開放概率；to：每個trace期間，單個通道的開放時間；∑t：指令電壓下，第一次刺激下通道開放持續(xù)的總的時間；T：總的刺激時間。④pClamp10軟件分析結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測細(xì)胞活性 運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測，ASMCs與50 ng/ml IL-1β共培養(yǎng)12 h，與對照組比較，凋亡比例變化無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）（圖1）。

2.2 阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對ASMCs細(xì)胞內(nèi)H2O2水平影響 與對照組比較，50 ng/ml IL1β與ASMCs共培養(yǎng)12 h細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度達(dá)68.1±5.61 μmol/ml（對照組33.6±2.8 μmol/m1，P＜0.05）。200 U/ml catalase（H2O2清除劑）可完全逆轉(zhuǎn)IL-1β對細(xì)胞內(nèi)H2O2的影響，IL-1β+catalase處理組濃度為38.2±3.0 μmol/ml，與IL-1β處理組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-1β+atorvastatin處理組H2O2濃度為33.1±2.6 μmol/ml，同樣可逆轉(zhuǎn)IL-1β對細(xì)胞內(nèi)H2O2的影響（P＜0.05）。與IL-1β+atorvastatin處理組比較，atorvastatin+IL-1β+catalase處理組細(xì)胞內(nèi)H2O2水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示catalase與阿托伐他汀無協(xié)同作用，阿托伐他汀可直接下調(diào)ASMCs細(xì)胞內(nèi)H2O2水平（圖2）。

圖1 ASMCs與IL-1β共培養(yǎng)細(xì)胞活性檢測

圖2 阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對ASMCs細(xì)胞內(nèi)H2O2水平影響

2.3 阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對ASMCs細(xì)胞膜電位影響 以熒光探針DiBAC4（3）染色的ASMCs熒光強(qiáng)度為指標(biāo)，50 ng/ml IL-1β與ASMCs共培養(yǎng)上調(diào)膜電位，以對照組為100%，IL-1β處理組熒光強(qiáng)度增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與IL-1β處理組比較，IL-1β+catalase處理組及IL-1β+100 μmol/l atorvastatin處理組熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05）。與IL-1β+atorvastatin處理組比較，IL-1β+atorvastatin+catalase處理組熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果提示阿托伐他汀可能通過降低H2O2水平逆轉(zhuǎn)IL-1β對膜電位影響（圖3）。

圖3 阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對ASMCs細(xì)胞膜電位影響

2.4 阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對ASMCs細(xì)胞膜BKca通道活性影響 內(nèi)面向外膜片（insideout patch）技術(shù)記錄單通道電流記錄BKca通道活性，IL-1β單獨(dú)處理ASMCs 12 h，與對照組比較，NPo明顯減少（P＜0.05），與IL-1β處理組比較，IL-1β+catalase處理組及IL-1β+100μmol/l atorvastatin處理組BKca通道NPo增加（P＜0.05）。與對照組比較，IL-1β+catalase處理組NPo無明顯差異（P＞0.05），但I(xiàn)L-1β+atorvastatin處理組NPo增加（P＜0.05），提示IL-1β通過H2O2下調(diào)BKca通道活性，但阿托伐他汀可直接增加BKca通道開放概率。實(shí)際上，對照組ASMCs加入阿托伐他汀處理后，BKca通道NPo增加（P＜0.05）。與IL-1β+atorvastatin處理組比較，IL-1β+atorvastatin+catalase處理組NPo差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與阿托伐他汀單獨(dú)處理比較，IL-1β+atorvastatin+catalase處理組同樣無明顯差別（P＞0.05）。以上提示阿托伐他汀通過降低H2O2水平增加BKca通道活性，同時可直接增加BKca通道活性（圖4）。

3 討論

BKca通道是協(xié)調(diào)細(xì)胞環(huán)境與細(xì)胞功能的關(guān)鍵膜蛋白質(zhì)，同時由于其分子結(jié)構(gòu)的多樣性及其相應(yīng)特異性表達(dá)，使得選擇性控制不同部位、不同生理功能的BKca通道成為可能。Matthias E研究表明，陰莖平滑肌細(xì)胞BKca通道功能不全和通道蛋白下調(diào)導(dǎo)致的血管高收縮反應(yīng)性是男性勃起功能障礙（ED）的重要原因，在BKca通道敲除的大鼠ED模型中，偉哥的擴(kuò)血管作用消失[12]。乙醇在低濃度鈣離子存在時開放BKca通道，而在高濃度鈣離子時則抑制該通道的開放，引起腦血管平滑肌不同的舒縮反應(yīng)[13]。過表達(dá)醛固酮合酶的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)冠狀動脈平滑肌細(xì)胞BKca通道蛋白表達(dá)及活性下調(diào)，冠脈血管呈高收縮反應(yīng)[14]。BKca可能是有前景的血管活性藥物作用靶點(diǎn)。

圖4 阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對ASMCs細(xì)胞膜BKca通道活性影響

IL-1β與冠心病、心力衰竭、血管痙攣等多種心血管疾病密切相關(guān)，而動脈平滑肌細(xì)胞膜電位的變化是上述疾病病理過程的共同特征[1]。前期工作已證實(shí)IL-1β影響B(tài)Kca通道活性，其機(jī)制至少部分通過細(xì)胞內(nèi)H2O2水平[9]。他汀類藥物明確降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，H2O2調(diào)節(jié)BKca通道活性，推測他汀類藥物抗炎作用可能與開放BKca通道活性有關(guān)。

本研究證實(shí)，阿托伐他汀降低與IL-1β共培養(yǎng)12 h的大鼠ASMCs細(xì)胞內(nèi)H2O2水平。100 μmol/l阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β上調(diào)膜電位的影響，H2O2清除劑catalase同樣可逆轉(zhuǎn)IL-1β對膜電位的影響。與IL-1β+atorvastatin處理組比較，IL-1β+atorvastatin+ catalase處理組熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示H2O2介導(dǎo)阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對膜電位的影響。以BKca單通道活性開放概率NPo為指標(biāo)，IL-1β處理組明顯下調(diào)細(xì)胞膜BKca通道NPo，預(yù)加入100 μmol/l阿托伐他汀或catalase可逆轉(zhuǎn)IL-1β對NPo影響。此外，阿托伐他汀直接上調(diào)ASMCs BKca通道活性。綜上得出，阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對膜電位及BKca通道活性的影響，部分通過H2O2介導(dǎo)，部分可能與其直接上調(diào)BKca通道活性有關(guān)。

動脈血管性疾病通常伴有內(nèi)皮受損，內(nèi)皮受損引起血管舒縮功能障礙，常表現(xiàn)為收縮反應(yīng)性增高。臨床使用鈣離子拮抗劑和硝酸脂類藥物改善血管舒縮功能障礙，因其影響心率、血壓、心外副作用及耐藥性問題，臨床療效不確切且增加患者醫(yī)療費(fèi)用負(fù)擔(dān)。平滑肌細(xì)胞超極化（膜電位下降）是血管內(nèi)皮受損導(dǎo)致舒張功能下降時的一種重要補(bǔ)償機(jī)制[15]。本文針對未滿足的臨床需要，提出BKca通道可能是改善血管收縮反應(yīng)性新的藥物靶點(diǎn)，阿托伐他汀可能治療有效。本實(shí)驗(yàn)提出BKca通道可能是動脈血管舒縮反應(yīng)性重要藥物作用靶點(diǎn)，阿托伐他汀可上調(diào)BKca通道活性治療動脈血管性疾病。