球托霉菌促進獼猴桃植株生長和抗病性探究

肖樂天

研究背景

獼猴桃植株栽培過程常因土壤中氮、鉀、磷等元素不足，導(dǎo)致植株生長緩慢、產(chǎn)量低、抗病能力弱，易發(fā)細菌性潰瘍等典型病害。而不合理施用化肥和農(nóng)藥又會帶來果品品質(zhì)下降、抗病性降低、農(nóng)殘超標、土壤板結(jié)及環(huán)境污染等問題。

微生物肥料是以微生物的生命活動及其代謝產(chǎn)物為核心，使農(nóng)作物獲得特定肥料效應(yīng)的一類肥料制品。與化肥相比，微生物菌肥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)優(yōu)勢明顯，如用量少、肥效持久、對人畜安全無毒、不污染環(huán)境，還能改善土壤結(jié)構(gòu)和保護土壤微生物多樣性等。不同種類作物需要的微生物菌肥種類也不盡相同，具體到獼猴桃栽培，目前還沒有相應(yīng)的專用菌肥產(chǎn)品。

球托霉菌W對土壤中有效氮、磷敏感，本次課題的研究目的就是研究其是否能作為微生物肥料以促進獼猴桃生長。

研究過程

植株生長指標測定：選擇120盆間苗移栽后獼猴桃植株，其中60盆用w5孢子懸浮液澆灌其培養(yǎng)基質(zhì)，使孢子密度達到1500個/cm3，60盆澆灌無菌水作為接種實驗的對照。澆灌接種后，每隔1個月隨機抽取處理組和對照組各6盆，用常規(guī)方法測定植株高度，待處理與對照株高有差異后，測定獼猴桃植株葉片數(shù)、莖粗、地上部分和根系鮮重，并使用根系掃描儀掃描測定葉面積、根面積等植株生長指標。

葉片葉綠素含量及其熒光參數(shù)的測定：采用葉綠素測定儀對獼猴桃植株完全展開的第2對真葉進行相對葉綠素含量測定。使用葉綠素熒光儀測定獼猴桃植株完全展開的第2對真葉的葉綠素初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、最大熒光與初始熒光差值（Fv）、PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、PSII潛在活性（Fv/Fo）、非光化學淬滅值（NPQ）及光化學淬滅值（qP）。

獼猴桃葉片光合作用測定：使用光合儀測定獼猴桃葉片光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度及蒸騰速率。

W5接種后獼猴桃植株細菌性潰瘍病抗性測定：用無菌牙簽從獼猴桃植株細菌性潰瘍病菌株JF8單菌落挑取致病菌少量，戳刺獼猴桃實生苗莖部第1對真葉和第3對真葉之間，深達木質(zhì)部;用無菌水作對照，接種方法同上。將接種后的獼猴桃植株置于溫度20℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后1周，觀察其發(fā)病情況。

除此之外，還分別對樣品進行了糖含量測定、W5生長碳源測定、菌絲侵染率測定、根際土壤有效磷含量測定等。

結(jié)果與分析

接種w5對獼猴桃植株生長指標的影響：接種w5菌株60天后，獼猴桃生長株高顯著高于對照組。此時對獼猴桃其他各項生理指標進行測定。結(jié)果顯示，w5處理60天后獼猴桃植株葉片數(shù)、莖粗、地上部分和根系鮮重、葉面積、根面積等生理指標均大于對照組獼猴桃。結(jié)果表明，接種w5至獼猴桃植株根部能夠促進獼猴桃植株的整體生長，特別是根系和葉片的生長。

接種w5對獼猴桃植株光合作用的影響：處理組SPAD值（Soil and plant analyzer development，土壤與作物分析開發(fā)，指一種測量濃度的方法。葉綠素含量SPAD，指用SPAD法測量的葉綠素濃度）為22.572±1.148，顯著高于對照組的18.988±1.549，表明接種w5可增加植株葉片中葉綠素含量。對獼猴桃葉片葉綠素熒光測定結(jié)果顯示，對照組和實驗組的葉綠素初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、最大熒光與初始熒光差值（Fv）差異不顯著然而，實驗組在Psn原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）和光化學淬滅值（qP）顯著高于對照組，說明w5處理后提高了葉片葉綠素原初光能轉(zhuǎn)化效率。葉片的光合作用效率測定結(jié)果顯示，處理組獼猴桃葉片的胞間CO2濃度和蒸騰速率均顯著高于對照組，說明接種w5促進了葉片的光合作用。

接種后獼猴桃植株對細菌性潰瘍病抗性測定結(jié)果：接種致病菌后10天開始觀察到葉片病斑，接種后15天，病斑顯著。接種1個月后測量莖上病斑面積，結(jié)果顯示，處理組潰瘍病病斑面積顯著小于對照組，說明其潰瘍病抗性高于對照組。

w5生長碳源：與葡萄糖和果糖相比，以蔗糖為碳源時，w5在液態(tài)培養(yǎng)條件下菌絲體增長最快，為最適碳源。w5菌株對不同碳源的利用效率為蔗糖>葡萄糖>果糖。

接種w5對獼猴桃植株糖含量影響：處理組葉片與對照組相比，果糖差異不顯著，但是葡萄糖和蔗糖含量均顯著增高。因處理組光合作用顯著高于對照組，而植物在葉片合成蔗糖后，大量的蔗糖會通過篩管的運輸運送到根系區(qū)域儲存，因此，處理組根部區(qū)域蔗糖含量顯著高于對照組蔗糖含量。

菌絲侵染率：w5處理后的獼猴桃植株根細胞及其間隙中存在有豐富的侵入菌絲及少量泡囊。結(jié)果表明，w5可通過與植株根系直接相互作用，促進植株生長。

土壤有效磷含量：使用鉬銻抗比色法測得對照組獼猴桃根際土壤有效磷含量為7.576±0.331mg/kg，處理組為5.656±0.337mg/kg，處理組顯著低于對照組，說明接種w5促進了獼猴桃植株對土壤磷的吸收。

討論與展望

本項目以w5菌株為對象，探討了其對獼猴桃植株生長的促進作用和機制。結(jié)果顯示，接種w5菌株60天后獼猴桃植株在株高、葉面積、植株鮮重、地上及地下部分重量等方面均顯著高于對照組（P<0.05），說明w5可以顯著促進獼猴桃植株生長，并增強對潰瘍病的抗性。

顯微觀察結(jié)果顯示，w5可入侵獼猴桃植株根系組織，與植物形成共生關(guān)系。文獻報道，對于菌根真菌，當其與植物形成共生后，會誘導(dǎo)植物增強光合作用，更多的光合作用產(chǎn)物也會從葉片部位流向根系。我們檢測了接種w5的獼猴桃植株的光合作用效率，結(jié)果顯示，其葉片的葉綠素含量提高、葉綠素原初光能轉(zhuǎn)化效率增加、光合作用增強。相應(yīng)地，我們發(fā)現(xiàn)葉片中葡萄糖、蔗糖含量顯著提高，根部蔗糖含量也顯著增加。這都表明，與絕大多數(shù)菌根真菌類似，w5入侵獼猴桃根系組織后，可誘導(dǎo)植株光合作用增強及光合產(chǎn)物的重新分配。然而，菌根真菌（如叢枝菌根菌）因缺乏蔗糖轉(zhuǎn)化酶而無法直接利用蔗糖，只能通過植物自身將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，然后利用單糖。與之不同的是，蔗糖是w5的最適碳源，其在蔗糖中的生長顯著優(yōu)于葡萄糖和果糖。因此我們推測，當w5入侵獼猴桃根系后，大量利用根部組織中蔗糖進行繁殖和生長，導(dǎo)致植株組織中蔗糖重新分布和積累，進而誘導(dǎo)了葉片增強光合作用。

一般情況下，真菌與植物互惠共生關(guān)系中，微生物依賴于宿主植物提供碳源生長和繁殖，作為回饋，微生物則通過分解土壤中的難溶礦物和元素，將其轉(zhuǎn)化為易溶性物質(zhì)，促進植物對礦物質(zhì)的吸收，促進植物生長。本研究以土壤中的磷元素為例進行了測定，實驗表明，處理組土壤中磷元素相較于對照組明顯減少，證明接種w5促進了植株對土壤磷元素的吸收和利用。另外，作為非致病菌，w5菌株在定植于根系細胞從植物獲取能源物質(zhì)的同時，可能通過菌絲的擴散增大與土壤接觸面積，從而促進植物對土壤中氮、磷、鉀等礦物質(zhì)的吸收，增加植株營養(yǎng)，促進植株生長，增強植株抗病性。后續(xù)，我們將測定接種w5前后獼猴桃根際土壤的其他礦物質(zhì)的含量變化，對不同的礦物質(zhì)進行同位素標記示蹤，進一步驗證此假說。

本項目初步探討了球托霉菌w5對“紅陽”獼猴桃植株生長的影響及其作用機制，為獼猴桃真菌菌肥研發(fā)提供了實驗依據(jù)。關(guān)于球托霉菌促進獼猴桃植株生長和抗病害的精細機制有待進一步研究。