RORα對(duì)人胃癌細(xì)胞株AGS凋亡的影響

俞浩遠(yuǎn) 梁瑞 王晶晶 汪正廣

摘要：目的? 探尋維甲酸相關(guān)孤兒受體（RORα）對(duì)于人胃癌細(xì)胞AGS的凋亡的影響。方法? 根據(jù)處理濃度不同將以1 μmol/L的SR001處理的AGS設(shè)為1 μmol/L濃度組，將以0.1 μmol/L的SR001處理的AGS設(shè)為0.1 μmol/L濃度組，另設(shè)溶媒組及對(duì)照組，分別給予等量的溶媒、等量喜樹堿（50 μmol/L）處理。采用MTT檢測(cè)化療藥物5-FU介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表達(dá)及cleaved caspase-3的蛋白的含量并比較。結(jié)果? 用RORα激動(dòng)劑處理可顯著增加5-FU介導(dǎo)的AGS細(xì)胞凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;RORα激動(dòng)劑處理48h后，人胃癌細(xì)胞中磷酸化RORα的表達(dá)增高，cleaved caspase-3的蛋白含量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? RORα可以提高人胃癌細(xì)胞AGS5-中FU介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，具有作為化療藥物的增敏劑的潛質(zhì)。

關(guān)鍵詞：RORα;胃癌;化療增敏劑

中圖分類號(hào)：R735.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.16.020

文章編號(hào)：1006-1959（2019）16-0066-04

Abstract：Objective? To investigate the effect of retinoic acid-related orphan receptor （RORα） on apoptosis of human gastric cancer cell AGS. Methods? According to the treatment concentration， AGS treated with 1 μmol/L SR001 was set to a concentration of 1 μmol/L， and AGS treated with 0.1 μmol/L SR001 was set to a concentration of 0.1 μmol/L， and a solvent group and a control group were additionally provided. An equal amount of vehicle and an equal amount of camptothecin （50 μmol/L） were separately administered. MTT was used to detect 5-FU-mediated apoptosis. The expression of phosphorylated RORα （p-RORα） and cleaved caspase-3 protein were detected by Western blot.Results? Treatment with RORα agonist significantly increased the apoptosis rate of 5-FU-mediated AGS cells，the difference was statistically significant（P<0.05）. After treatment with RORα agonist for 48 h， the expression of phosphorylated RORα was increased in human gastric cancer cells，The protein content of cleaved caspase-3 increased， the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion? RORα can increase the apoptosis of human gastric cancer cell AGS5-FU， and it has the potential as a sensitizer for chemotherapy drugs.

Key words：RORα;Gastric cancer;Chemotherapy sensitizer

胃癌（gastric cancer，GC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，全球約25%胃癌患者在中國(guó)，其發(fā)病率在男性惡性腫瘤中僅次于肺癌占第2位，在女性惡性腫瘤中居第4位，胃癌的死亡率在我國(guó)居惡性腫瘤首位[1，2]?；熢谖赴┚C合治療中發(fā)揮了重要作用，成為其治療的主要方法之一。近年來，研究發(fā)現(xiàn)化療增敏劑可提高化療藥物的療效，為胃癌的綜合治療帶來新的曙光，維甲酸相關(guān)孤兒受體（retinoid-related orphan receptors alpha，RORα）抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和乳腺癌細(xì)胞侵襲能力，但其是否具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用報(bào)道罕見。以往研究顯示，RORα在人正常胃組織中的表達(dá)明顯高于人胃癌組織，并且隨著TMN 分期增長(zhǎng)，RORα在人胃癌組織的表達(dá)量逐漸減少[3]，本研究旨在初步探討RORα對(duì)胃癌的影響及其可能的分子機(jī)制，用藥物SR1001處理人胃癌細(xì)胞AGS，檢測(cè)處理后細(xì)胞生物學(xué)行為改變，并檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)來探討其潛在的分子機(jī)制，為應(yīng)用于RORα作為臨床治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要材料? 人胃腺癌細(xì)胞AGS購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物存庫(kù)（American type culture collection，ATCC），RORα激動(dòng)劑SR1001購(gòu)于美國(guó)Cayman公司（規(guī)格：1 mg貨號(hào)：10922），胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，F(xiàn)12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，小鼠抗人單克隆抗體β-actin 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，蛋白裂解液（Tris-HCl、pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%Triton，0.1% SDS，5 mg/ml Leupeptin，1 mmol/L PMSF），MTT細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自Beyotime公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)? AGS培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素及鏈霉素）的F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2、飽和濕度，每2 d更換1次培養(yǎng)基，并種植于6孔板中，細(xì)胞密度為1×106/2 ml。根據(jù)處理濃度不同分組，將以1 μmol/L的SR001處理的設(shè)為1 μmol/L濃度組，將以0.1 μmol/L的SR001處理的設(shè)為0.1 μmol/L濃度組;另設(shè)溶媒組及對(duì)照組，分別給予等量的溶媒、等量的喜樹堿（50 μmol/L）。

1.3 MTT試劑盒檢測(cè)RORα對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響? 取經(jīng)培養(yǎng)好的AGS，消化后進(jìn)行細(xì)胞濃度檢測(cè)，并用培養(yǎng)基調(diào)整至5000 個(gè)/100μl;加入96孔板中，SR1001 1 μmol/L濃度組，0.1 μmol/L濃度組及溶媒組每孔加入10 μl的5-FU（10 μg/ml），對(duì)照組每孔加入對(duì)照藥物（50 μmol/L喜樹堿），PBS封閉周圍一圈，每孔加入10 μl配制好的MTT溶液，輕輕混勻，培養(yǎng)箱中孵育4 h后取出，再給予每孔加入100 μl試劑盒中的Formazen溶解液，輕柔混勻繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中孵育4 h，使用普通光學(xué)顯微鏡下觀察，當(dāng)紫色結(jié)晶全部溶解后，采用酶標(biāo)儀在570 nm測(cè)定吸光度值，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)? 根據(jù)不同的處理方法將AGS細(xì)胞分組，分別為SR1001 1 μmol/L濃度組，0.1 μmol/L濃度組及溶媒組。細(xì)胞處理24h后用PBS 洗3遍，用細(xì)胞刮刮下培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，并用移液槍把液體吸到標(biāo)記好的1.5 ml EP管中，每瓶加入蛋白裂解液100 μl，放置于冰上裂解30 min，每10 min振蕩混勻1次，4 ℃高速冷凍離心機(jī)以14000 r/min離心30 min吸取上清液，加入蛋白上樣緩沖液，充分混勻，于沸水中煮沸10 min后置-80℃保存。根據(jù)BCA蛋白定量，每組取含有等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h 后，用含0.05% Tween-20 的TBS 洗膜3遍，分別加入Caspase-3、β-actin抗體4℃孵育過夜，再用含0.05% Tween-20 的TBS 洗膜3遍后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBS洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒顯影。用軟件image J測(cè)定各條帶的灰度值，以β-actin 為參照，計(jì)算相對(duì)條帶的灰度值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5觀察指標(biāo)? 觀察MTT檢測(cè)化療藥物5-FU介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況，AGS細(xì)胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表達(dá)及cleaved caspase-3的蛋白的含量并比較。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料使用（x±s）表示，采用單因素方差分析（oneway-ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 RORα激動(dòng)劑對(duì)AGS細(xì)胞中RORα磷酸化的影響? 采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表達(dá)結(jié)果顯示，與溶媒組比較，SR1001可以增強(qiáng)AGS細(xì)胞中p-RORα蛋白的表達(dá)，見圖1A，并采用image J檢測(cè)相關(guān)條帶的灰度值的相對(duì)百分比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1B。

2.2 RORα激動(dòng)劑對(duì)5-Fu介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率的影響? RORα激動(dòng)劑處理顯著增加5-FU介導(dǎo)的AGS細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.3 RORα對(duì)細(xì)胞中凋亡蛋白的影響? ?RORα激動(dòng)劑處理后cleaved caspase-3水平增加，見圖3A。 ImageJ軟件測(cè)量圖3A中 cleaved caspase-3條帶的灰度值并計(jì)算其相對(duì)于溶媒組的百分比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3B。

3討論

RORs是核受體的一個(gè)家族，是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的一員。RORs 包括RORα（NR1F1）， RORβ（NR1F2）及RORγ（NR1F3）三個(gè)成員，RORα最早于上世紀(jì)九十年代被發(fā)現(xiàn)，因結(jié)構(gòu)與維甲酸受體及維甲類X受體相似而得名[4]，之后RORβ和RORγ被依次發(fā)現(xiàn)。RORα、RORβ及 RORγ在不同種屬及不同組織中表達(dá)不同，RORα廣泛分布于肝臟、骨骼肌、皮膚、脂肪組織、腎臟、胸腺及腦組織中，RORα有α1、α2、α3、α4四種亞型，在鼠類中僅存在α1和α4兩種亞型[5，6];RORβ有β1，β2兩種亞型，只有β1亞型存在人類中，RORβ的表達(dá)與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)，分布于腦及視網(wǎng)膜。RORγ有γ1，γ2兩種亞型，分布于免疫系統(tǒng)，RORγ2高度表達(dá)于胸腺組織，故也常被稱為RORγt。RORs能識(shí)別特定的DNA序列（通常由TAAA/ TNTAGGTCA組成），即ROR反應(yīng)元件（RORE），作為單體與之結(jié)合，而不像大多數(shù)受體以二聚體形式結(jié)合，這也是其被稱為孤兒受體的原因。

RORα廣泛分布于組織中，被稱為生物節(jié)律，脂質(zhì)代謝和免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。研究表明RORα可能在癌癥發(fā)展中起作用，腫瘤微環(huán)境在結(jié)直腸癌中至關(guān)重要。RORα抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞增殖，遷移和誘導(dǎo)血管生成，是通過影響脂肪細(xì)胞的方式來介導(dǎo)[7]，有研究表明，與癌旁組織相比，在肝癌細(xì)胞中存在RORα低表達(dá)的情況，并且這種表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征有相關(guān)性，低RORα表達(dá)的肝癌患者具有較高的AFP水平，較差的病理學(xué)分級(jí)，腫瘤復(fù)發(fā)和血管侵入的傾向。然而，在RORα表達(dá)與年齡，性別，乙型肝炎血清抗原（HBsAg）狀態(tài)，腫瘤大小或肝硬化之間未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性。此外，RORα與腫瘤患者預(yù)后有關(guān)，低RORα表達(dá)的患者具有比高表達(dá)的患者總體生存率更低，無病生存時(shí)間更短[8]。

有研究顯示RORα參與前列腺素介導(dǎo)的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，并且似乎更像是是中心分子開關(guān)[9，10]。在肝細(xì)胞肝癌中，約65%的患者存在RORα低表達(dá)，且其總體生存率和無病生存時(shí)間更短[8]，另外RORα高表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞增殖與遷移侵襲，將細(xì)胞阻滯于G2/M期，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-9和上調(diào)TIMP3有關(guān)[11]。本研究中采用RORα激動(dòng)劑SR1001來提高RORα的磷酸化，并采用MTT試劑盒檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于溶媒組，提高RORα的磷酸化后，5-FU介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率增加，并且相關(guān)凋亡蛋白含量增高，表明RORα可以增加5-FU介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，RORα可以增加5-FU介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的凋亡，具有作為5-FU化療藥物的增敏劑的潛質(zhì)，為研發(fā)新型的化療藥物或增敏劑提供新的思路。

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收稿日期：2019-5-25;修回日期：2019-7-3

編輯/肖婷婷