三種評估大鼠受孕方法的比較

劉琳 張燕 杜明鈺 馬潤玫

摘要：目的? 比較陰栓檢查法、陰道涂片法和孕中期腹部觸診法判斷SD大鼠受孕的準確性，為高效構建SD孕鼠模型提供參考。方法? 于2018年1月～3月選取50只未生育過的雌性SPF級SD大鼠，9只SPF級雄性SD大鼠，隨機交配后分別用陰栓檢查法、陰道涂片法和孕中期腹部觸診法檢查大鼠受孕情況，以解剖發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)存在仔鼠為受孕成功的標準，比較三種方法檢出大鼠受孕的成功率。結果? 腹部觸診法判斷大鼠受孕的成功率為100.00%，陰道涂片法為90.00%，陰栓檢查法為40.00%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論? 孕中期腹部觸診法對確定大鼠受孕成功的準確率最高，但是需結合確定大鼠交配成功準確率較高的陰道涂片法共同判斷。

關鍵詞：陰栓;陰道涂片;腹部觸診;SD大鼠

中圖分類號：Q492.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.16.017

文章編號：1006-1959（2019）16-0055-03

Abstract：Objective? To compare the accuracy of pregnancy in SD rats by comparing the method of vaginal suppository examination， vaginal smear and mid-abdominal palpation， and provide reference for the efficient construction of SD pregnant mice.Methods? From January to March 2018， 50 female SPF SD rats and 9 SPF male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups. The rats were randomly mated with vaginal smear， vaginal smear and mid-pregnancy. The palpation method was used to check the pregnancy condition of the rats. The sputum was found to be the standard for successful pregnancy in the uterus. The success rate of the conception of the rats was compared by three methods.Results? The palpation rate of the abdomen palpation method was 100.00%， the vaginal smear method was 90.00%， and the vaginal suppository method was 40.00%，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion? The palpation method in the second trimester of pregnancy has the highest accuracy in determining the success of pregnancy in rats， but it needs to be judged together with the vaginal smear method that determines the high accuracy of mating success.

Key words：Vaginal plug;Vaginal smear;Abdominal palpation;SD rat

大鼠體型較小，與人類遺傳學較為一致，對實驗條件反應較為相似，常被譽為精密的生物研究工具。其妊娠期為19～23 d，平均21 d[1]，排卵通常在發(fā)情后8～10 h，發(fā)情多在夜間[2]。在動物實驗中，因實驗要求，常會用到孕鼠模型。目前對大鼠是否受孕的判斷使用較多的主要有外部體型直接觀察法、外陰及陰道分泌物觀察法、陰栓檢查法、陰道涂片法等。大鼠合籠交配后，雌鼠的陰道口形成一種特殊的膣栓即陰栓。陰栓是雄鼠的精液、雌鼠的陰道分泌物與陰道上皮細胞的混合物遇空氣后迅速變硬形成的。但陰栓脫落較早，使用陰栓檢查法判斷大鼠受孕漏檢率較高，目前多使用陰道涂片法，顯微鏡下看到精子即為交配成功。但看到陰栓和（或）精子只證明交配成功，不能證明已受孕，因存在假孕可能。為比較不同方法判斷大鼠受孕成功的準確性，本實驗分別采用陰栓檢查法、陰道涂片法和孕中期腹部觸診法對大鼠受孕進行判斷，旨在為確定大鼠受孕提供更為準確、高效的辦法。

1材料與方法

1.1實驗材料? 本實驗方案已通過昆明醫(yī)科大學動物實驗倫理審查委員會審查同意，審批許可號為KMMU2018032。①實驗動物：于2018年1月～3月選取50只未生育過的2～3月齡雌性SPF級SD大鼠，體重230～300 g，9只SPF級雄性SD大鼠，體重280～300 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[實驗動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002]。 ②條件：室內(nèi)溫度21～25℃，相對濕度50%～60%，明暗周期為12 h/12 h，分籠飼養(yǎng)，實驗期間自由飲用自來水，食用標準普通柱狀飼料。動物飼養(yǎng)設施條件為屏障設施環(huán)境[SCXK（滇）K2015-0002]。③器材與試劑：OLYMPUS CH30 型光學顯微鏡（日本，北京城夕科技有限公司）、潔凈磨砂玻片（泰州市思齊教學儀器有限公司）、消毒棉簽（河南飄安集團有限公司）、生理鹽水。

1.2方法? 將50只SD雌鼠隨機編號，于每日17∶00合籠，合籠雌鼠與雄鼠（個數(shù)比為雌∶雄=3∶1）共同置于未放墊料的潔凈籠具內(nèi)。第2天8∶00，取出雄鼠繼續(xù)正常喂養(yǎng)，休養(yǎng)后繼續(xù)進行下一輪合籠。

1.2.1陰栓觀察法? 將待檢查的雌鼠置于操作臺上（避免尚未檢查的雌鼠受其影響），輕柔安撫雌鼠，拇指和食指捏住其尾巴，其余三指輕壓其后腰背部（此固定方法對于活躍的大鼠更為適合[3]）。翻起尾巴露出外陰，清理糞便后用生理鹽水潤濕的無菌棉簽輕觸陰道口，如發(fā)現(xiàn)有乳白或淡黃色固態(tài)栓狀物即為陰栓，有陰栓者即交配成功，記為妊娠第“0”天。

1.2.2陰道涂片法? 合籠雌鼠行陰栓檢查后，如未發(fā)現(xiàn)陰栓則繼續(xù)行陰道涂片檢查。將用生理鹽水潤濕的無菌棉簽輕插入雌鼠陰道，在陰道口稍作停留以便雌鼠適應，然后繼續(xù)輕輕進入陰道約1.5 cm，緩慢轉動2圈后輕柔拔出棉簽，將棉簽上的附著物均勻涂在載玻片上鏡檢（10×10）。若看到細長形、略有彎曲、頭端稍膨大的精子即交配成功，記為妊娠第“0”天。

1.2.3孕中期腹部觸診法? 看到陰栓和（或）精子的雌鼠停止合籠，單獨喂養(yǎng)，其余繼續(xù)合籠直至觀察到陰栓和（或）精子。交配成功的雌鼠于妊娠第14天進行孕中期腹部觸診。孕中期在雙側腹部觸及多個花生米大小、質(zhì)韌、可推動、成串珠狀排列的組織團塊即為胚胎，為受孕成功的標志。

1.2.4解剖檢查? 將所有確定為交配成功的雌鼠于妊娠第20天進行解剖，檢查雙側子宮，如有胎鼠存在，證實受孕成功，否則為受孕失敗。

1.3統(tǒng)計學方法? 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行處理，計數(shù)資料采用（%）表示，進行？字2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1大鼠受孕情況? 在整個實驗過程中，50只SD大鼠中共有40只SD雌鼠受孕成功，另有6只證實交配成功但經(jīng)腹部觸診及解剖證實并未受孕，而4只SD大鼠交配及受孕均未成功，經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)這4只大鼠雙側子宮內(nèi)存在透亮積液，可能因此導致無法正常受孕。

2.2三種方法檢出情況? 陰栓檢查法、陰道涂片法、腹部觸診法確定交配成功孕鼠數(shù)、解剖時見胎鼠孕鼠數(shù)、錯檢受孕鼠數(shù)、未檢出受孕鼠數(shù)等各項指標比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.3陰道涂片檢查情況? 涂片時見多量（近全視野）角化上皮細胞，當晚合籠后次日大多可見精子，可單獨出現(xiàn)，也可伴隨多量上皮細胞出現(xiàn)，見圖1。

2.4三種方法的檢出率、假陽性率、假陰性率比較? 腹部觸診法檢查大鼠受孕成功的檢出率最高，為100.00%（40/40），其次是陰道涂片法，檢出率為90.00%（36/40），陰栓檢查法檢出率最低，為40.00%（16/40）;三種方法假陽性率比較，腹部觸診法最低，為0（0/40），陰栓檢查法為7.50%（3/40），陰道涂片法最高，為15.00%（6/40）;腹部觸診法檢查的假陰性率最低，為0（0/40），陰栓檢查法最高，為60.00%（24/40），陰道涂片法為10.00%（4/40）。

3討論

在婦產(chǎn)科學、生殖醫(yī)學及相關醫(yī)學研究中，如何高效構建孕鼠模型是確保實驗順利進行的關鍵因素之一。目前，比較常用到的判斷大鼠受孕的方法主要有四種：外部體型直接觀察法、外陰及陰道分泌物觀察法、陰栓檢查法、陰道涂片法。但因實驗環(huán)境和飼養(yǎng)條件不同，不同大鼠受孕后外部體型可能各有不同，且受不同實驗者主觀性影響，外部體型直接觀察法、外陰及陰道分泌物觀察法對判斷大鼠是否受孕準確性不高。本實驗主要對其中的陰栓檢查法、陰道涂片法以及實驗中觀察分析得到的腹部觸診法做出研究。

大鼠性周期為4～5 d，典型的4 d性周期分為發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期。大鼠排卵通常在發(fā)情后8～10 h，發(fā)情多在夜間。劉曉宇等[4]研究顯示，大鼠陰部外觀及陰道分泌物與動情周期有一定關系。在做陰道涂片的同時觀察陰部外觀及陰道分泌物的性質(zhì)。隨著周期的變化，陰部可見紅腫充血，陰道分泌物時而干燥，時而呈拉絲狀。但與涂片對比，外陰及陰道分泌物觀察法不具有特異性，不宜采用此法進行大鼠受孕的判斷。發(fā)現(xiàn)陰栓和（或）精子是確定大鼠交配成功的標志，并不能保證受孕成功。因此，找到一種判斷大鼠受孕成功準確性相對較高的方法非常重要。

陰栓一般在交配后12～24 h自動脫落[2]。本實驗過程中陰栓檢查法判斷大鼠受孕成功的檢出率最低，原因可能與無法準確了解大鼠交配時間且陰栓易脫落有關。陰栓檢查雖然直觀可信，但實際上陰栓有無的判定往往很困難，觀察的時間過早，可能還沒有形成栓，觀察的時間過晚，陰栓可能已經(jīng)液化或者脫落[5]，也可能被雌鼠清除[6]。因此，單純通過檢查陰栓確定大鼠受孕成功的結論缺乏嚴謹性。

陰道涂片法對于孕早期判斷大鼠受孕具有重要意義，受孕大鼠中多數(shù)在涂片中可發(fā)現(xiàn)細長形、略有彎曲、頭端稍膨大的精子，但是假陽性率較高，說明看到精子存在只能證實交配成功，并不能證實受孕成功。原因可能是雌鼠在交配時并非處于動情期，由強壯的雄鼠強迫與其受孕，因此未能排卵，精卵結合不成功導致受孕失敗[7]，也可因環(huán)境等因素導致[8]。另外，動物的繁殖高峰期為春季，本實驗于夏季進行，且與其他實驗所用大鼠共同飼養(yǎng)于動物房，季節(jié)變化及同類影響因素均需予以考慮。降低假陽性率的方法可采用孕中期腹部觸診法，一般于磁鼠妊娠第14天進行檢查，若早于此時期，因胚胎較小及母鼠可能出現(xiàn)的子宮積液的干擾，無法直觀準確判斷是否受孕成功;若晚于此時期，有些未成功受孕的大鼠則無法提前篩選出，造成實驗周期的延長。孕中期觸診可觸及仔鼠大小及輪廓，判斷準確率極高，假陰及假陽性率皆為三種方法中最低。

在本次實驗中，經(jīng)陰道涂片發(fā)現(xiàn)，若將當天涂片中為多量（近全視野）角化上皮細胞的雌鼠當晚合籠，次日涂片多可見精子，精子可單獨出現(xiàn)，也可伴隨多量角化上皮細胞出現(xiàn)。由此可見，多量上皮細胞是雌鼠發(fā)情的特異性標志，此時合籠可提高受孕率。多量上皮細胞的出現(xiàn)天數(shù)是否與發(fā)情天數(shù)準確相符，可進行進一步研究。

綜上所述，陰道涂片法和孕中期腹部觸診法聯(lián)合應用于孕中期即可證實雌鼠是否受孕，具有準確、簡便、實用等優(yōu)點，可有效提高孕鼠檢出率及降低假陽性受孕的發(fā)生率，對于構建孕鼠模型具有重要意義。

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收稿日期：2019-5-20;修回日期：2019-5-30

編輯/成森