外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其趨化因子受體CCR9與非小細(xì)胞肺癌的臨床相關(guān)性

林思陽，蒿艷蓉，呂艷茹，馮國生，林 輝，李柏鈞，袁賢彬，曹宇華，侯恩存，陸 翔

0 引 言

在最新發(fā)布的《2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)》中，肺癌仍然以11.6%的發(fā)病率與18.4%的病死率高居全球惡性腫瘤首位［1］。在中國，肺癌仍是發(fā)病率與病死率最高的惡性腫瘤［1］。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）檢測是備受關(guān)注的“液體活檢”技術(shù)，并證實其在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等腫瘤的診斷、治療、預(yù)后中有積極的臨床應(yīng)用價值［2-6］。

CTCs是具有變形能力的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞，可攜帶原發(fā)腫瘤特異性抗原與基因特征從原發(fā)腫瘤中脫落，侵襲進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。在遷移過程中，新基因突變（如休眠相關(guān)基因、凋亡抑制相關(guān)基因）使CTC獲得逃避機(jī)體免疫監(jiān)視與免疫清除的特性［7］；而上皮間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程不僅可增強(qiáng)CTCs的抗凋亡能力，EMT過程導(dǎo)致的CTCs表型改變還可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤從原發(fā)病灶的轉(zhuǎn)移與侵襲［8-9］。此外，部分CTCs還具有干細(xì)胞特征，在克服了血流剪切力的機(jī)械破壞和逃避機(jī)體免疫監(jiān)視后可遷徙轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官形成新病灶［10］。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞是惡性腫瘤出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要因素。

趨化因子受體9（chemokine receptor 9，CCR9）是一類具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體；趨化因子受體配體CCL25是其特異性配體。CCR9/CCL25參與調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫細(xì)胞分化、發(fā)育，白細(xì)胞定向遷移，調(diào)控免疫應(yīng)答等多個生理過程，并與多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及血管生成相關(guān)［11］。CCR9-CCL25軸可通過調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬酶（MMP2、MMP9）及其組織特異性抑制物（TIMP-1、TIMP-2）的表達(dá)水平促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，與患者的預(yù)后相關(guān)［12］。本研究旨在探討CTCs及CTCs中CCR9表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的臨床相關(guān)性，探討其在NSCLC篩查及腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)測中的潛在作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2018年5月至2019年6月就診于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院臨床腫瘤中心的NSCLC患者共62例。所有患者均經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)確診，其中肺腺癌43例、肺鱗癌15例、其他病理類型NSCLC 4例；男31例、女31例，年齡36～79歲，平均（58.0±8.9）歲；I-ⅢA期16例、ⅢB-Ⅳ期46例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移37例、無轉(zhuǎn)移25例；腫瘤大小T1-T2期36例、T3-T4期26例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲，性別不限；②PS評分0～2分；③血紅蛋白≥100.0 g/L、WBC≥4.0×109/L、血小板≥100.0×109/L；④肝功能：ALT、AST＜正常值上限（upper limit of normal，ULN）的1.5倍，總膽紅素＜1.5×ULN；⑤腎功能：血清肌酐＜1.5×ULN；⑥生存時間＞3個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①曾患其他惡性腫瘤；②近1個月內(nèi)接受過其他藥物試驗的受試者；③不同意參加試驗者；④嚴(yán)重肺部或心臟疾病病史者；⑤濫用藥物或酒精成癮者；⑥有人格或精神疾患，無民事行為能力或限制民事行為能力者。本實驗通過廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審查（批準(zhǔn)號：科研廣西科技-2016-01號）。所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血液標(biāo)本使用EDTA抗凝采血管采集NSCLC患者外周血2管，每管5 mL，顛倒充分混勻，標(biāo)本置于4℃冰箱保存，并在4 h內(nèi)完成檢測。

1.3 CTCs檢測CanPatrol CTC二代富集技術(shù)（CanpatrolTMCTC技術(shù)）由益善生物技術(shù)股份有限公司提供。CTCs檢測方法分2個步驟。①使用納米過濾方法分離CTCs：過濾前使用紅細(xì)胞裂解緩沖液除去血液中的紅細(xì)胞，然后將細(xì)胞重懸在含4%甲醛的磷酸緩沖鹽溶液中8 min，調(diào)整真空泵的壓力為0.08 MPa，通過一個孔徑為8μm的濾過膜截留CTCs；②基于分支DNA信號擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行RNA原位雜交（RNA-ISH）：使用RNA-ISH檢測CD45、Ep-CAM、CK8/18/19、Vimentin、Twist等靶向序列，對上述所有基因進(jìn)行特異性RNA探針雜交，使用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）對細(xì)胞核進(jìn)行染色5 min，在100倍油鏡下使用自動化熒光掃描顯微鏡對樣本進(jìn)行觀察，根據(jù)EMT標(biāo)志物確認(rèn)出不同類型的CTCs。

1.4 CTCs鑒定在入組血液樣本中加入特異性上皮生物標(biāo)記探針EpCAM、CK8/18/19和間質(zhì)型生物標(biāo)記探針Vimentin、Twist進(jìn)行雜交，雜交擴(kuò)增后加入熒光染料Alexa Fluor594（用于標(biāo)記上皮生物標(biāo)記探針EpCAM、CK8/18/19）和Alexa Fluor488（用于標(biāo)記間質(zhì)型生物標(biāo)記探針Vimentin、Twist），使用DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察CTCs的基因表型。

1.5 CTCs中CCR9表達(dá)的檢測56例CTCs檢測陽性的NSCLC患者中40例患者進(jìn)行CTC CCR9表達(dá)水平的檢測，使用多重mRNA原位分析方法（Multiple mRNAin situanalysis，MRIA）檢 測 CTC 中CCR9的表達(dá)，并使用熒光染料Alexa Fluor647進(jìn)行標(biāo)記，紫色熒光信號為CCR9表達(dá)陽性。熒光信號點數(shù)0個為無表達(dá)，1～3個為低表達(dá)，4～9個為中表達(dá)，≥10個為高表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較比較采用χ2檢。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CTCs計數(shù)與NSCLC患者臨床、病理的關(guān)系NSCLC患者中CTCs陽性率為90.3%（56/62），其中I-ⅢA期NSCLC患者CTCs計數(shù)低于ⅢB-Ⅳ期NSCLC患者（t=-3.426，P=0.001）。T3-T4期NSCLC患者CTCs計數(shù)水平高于T1-T2期患者（t=-2.141，P=0.039）。此外，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者CTCs計數(shù)水平亦高于無轉(zhuǎn)移的NSCLC患者（t=-2.558，P=0.013）。而肺腺癌與肺鱗癌患者以及CEA＜5μg/L 與 CEA＞5μg/L的 NSCLC患者 CTCs計數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床、病理特征NSCLC患者的CTCs計數(shù)水平比較Table 1 CTCs levels of NSCLC patients with differentclinical and pathological characteristics

2.2 CTCs計數(shù)與NSCLC臨床、病理的相關(guān)性CTCs計數(shù)與NSCLC腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及腫瘤大小T分期均呈正相關(guān)（P＜0.05）；但與NSCLC患者的年齡、性別、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平、臨床病理類型均無相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

表2 CTCs計數(shù)與NSCLC臨床、病理的相關(guān)性分析Table 2 Univariate analysis of the correlation between CTC and clinical and pathological features of NSCLC

2.3 CTCs亞型與NSCLC臨床、病理的相關(guān)性本研究發(fā)現(xiàn)，上皮型CTCs計數(shù)與NSCLC的TNM分期及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），與腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA水平及患者性別均無相關(guān)性；而混合型CTCs計數(shù)與NSCLC腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），但并未發(fā)現(xiàn)其與腫瘤分期、腫瘤大小、腫瘤病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA值及性別有相關(guān)性。見表3、表4。

表3 上皮型CTCs計數(shù)與NSCLC臨床、病理的相關(guān)性分析Table 3 Correlations between epithelial CTC and clinical and pathological features of NSCLC

表4 混合型CTCs計數(shù)與NSCLC臨床、病理的相關(guān)性分析Table 4 Correlations between epithelial/mesenchymal hybrid CTC and clinical and pathological features of NSCLC

組間差異性比較中，IIIB-IV期NSCLC患者上皮型CTC陽性率高于I-IIIA期NSCLC患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.891，P=0.005）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者上皮型CTCs陽性率亦高于無轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.147、P=0.013），見表5。

表5 上皮型CTCs陽性率與NSCLC臨床、病理的關(guān)系（n）Table 5 The correlations between mesenchymal CTC positive rate and clinical and pathological features of NSCLC（n）

2.4 CTCs的CCR9陽性率及表達(dá)水平與NSCLC的臨床相關(guān)性本組NSCLC患者中，40例CTCs檢測陽性，并進(jìn)行CCR9表達(dá)水平的檢測?；旌闲虲TCs中，CCR9陽性率僅與NSCLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.036）。組間差異性分析結(jié)果顯示，僅在不同性別NSCLC患者間CCR9陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004）；而不同病理類型、轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分期以及CEA水平的NSCLC患者CCR9陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表6。

表6 混合型CTCs中CCR9陽性率與NSCLC臨床、病理的關(guān)系（n）Table 6 The correlations between CCR9 positive percentage of epithelial/mesenchymal hybrid CTC and clinical and pathological features of NSCLC（n）

3 討 論

肺癌高?；颊叩暮Y查，首推低劑量螺旋CT掃描；但對于直徑＜1.0 cm的肺部結(jié)節(jié)，CT顯像不佳，患者還要承受放射性輻射與造影劑過敏的雙重風(fēng)險［13］。從時效性方面而言，CT檢查具有滯后性；而CTCs可在肺部病變出現(xiàn)前6～9周表現(xiàn)異常。相對于有創(chuàng)的活組織檢查而言，CTC只需簡單的抽血就可檢測，患者接受度、配合度更高，對因高齡、基礎(chǔ)疾病多、一般情況差、無法確認(rèn)原發(fā)病灶等各種原因而不能進(jìn)行活組織檢查的患者而言，CTCs可成為一項優(yōu)選方案。CTCs對于肺癌高?；颊叩暮Y查有積極意義。

上皮間質(zhì)化過程是腫瘤從原發(fā)病灶中脫落，侵襲進(jìn)入血液循環(huán)并轉(zhuǎn)移形成新病灶的重要途徑，外周血中CTCs的存在亦預(yù)示著腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于無轉(zhuǎn)移的NSCLC患者，具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者CTCs檢測的陽性率更高，且CTCs計數(shù)的平均值更大；而具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者CTCs計數(shù)亦比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者更多。這與此前Muinelo等［15］和Lim等［16］的研究結(jié)果一致。在CTCs與NSCLC臨床、病理的相關(guān)性研究中，CTCs計數(shù)是NSCLC患者腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素。對于早期NSCLC患者而言，晚期NSCLC患者CTCs計數(shù)更多。CTCs的存在預(yù)示著NSCLC患者的預(yù)后不良。在Yang等［17］研究中亦發(fā)現(xiàn)，CTCs計數(shù)更高的NSCLC患者有著更短的無進(jìn)展生存期（Progress Free Survival，PFS）和總生存期（Overall survival，OS），CTC可作為NSCLC患者預(yù)后預(yù)測的指標(biāo)［14，18-19］。

此外，在不同CTCs分型與NSCLC臨床、病理相關(guān)性的探索中，本研究還發(fā)現(xiàn)上皮型CTCs計數(shù)與NSCLC的TNM分期及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。IIIB-IV期NSCLC患者上皮型CTC陽性率高于I-IIIA期NSCLC患者。上皮型CTC與NSCLC患者預(yù)后相關(guān)，上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM）陽性CTCs是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的危險因素［20］。而具有上皮-間質(zhì)化特征的混合型CTC有著更強(qiáng)的經(jīng)血行轉(zhuǎn)移、遷徙至遠(yuǎn)隔器官的能力，與更差的PFS及OS相關(guān)［21］。本研究發(fā)現(xiàn)混合型CTCs計數(shù)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，與此前研究結(jié)果一致。但研究中并未發(fā)現(xiàn)間質(zhì)型CTCs與NSCLC患者臨床、病理的相關(guān)性，可能與入組病例數(shù)較少及腫瘤的異質(zhì)性有關(guān)，我們將繼續(xù)擴(kuò)大入組樣本量。

外周血中CTCs計數(shù)與CTCs亞型在一定程度上與NSCLC患者疾病狀態(tài)及生存預(yù)后相關(guān)。通過簡單抽取患者外周血檢測CTCs可推測患者的疾病狀態(tài)，并及時采取相應(yīng)的干預(yù)治療措施，對改善NSCLC患者預(yù)后及延長其生存時間具有深遠(yuǎn)意義。對于組織病理學(xué)、影像學(xué)檢查均提示為早期肺癌的患者，如外周血中檢測到的CTC數(shù)值較高，亦需警惕是否已經(jīng)發(fā)生了腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，需在接下來的隨訪時間里密切監(jiān)測患者的狀態(tài)。Ilie等［22］的前瞻性研究，對5名檢測出CTCs的肺部良性病變患者進(jìn)行了密切的觀察隨訪，在隨后的1～4年時間里，所有患者均發(fā)現(xiàn)了影像學(xué)可見的肺部結(jié)節(jié)并通過組織病理學(xué)確診為肺癌。CTCs對肺癌高?；颊叩暮Y查及肺癌患者的隨訪具有重要的潛在應(yīng)用價值。

而在此前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CCR9在NSCLC組織中高表達(dá)，CCR9-CCL25軸可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，并可通過上調(diào)PI3K/Akt通路產(chǎn)生抗凋亡作用，CCR9表達(dá)與NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)，混合型CTCs中CCR9陽性率與NSCLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，混合型CTCs是同時具有上皮和間質(zhì)特性的腫瘤細(xì)胞，提示CCR9可能參與了腫瘤的EMT過程與混合型CTCs的產(chǎn)生，CCR9可能通過EMT過程促進(jìn)CTCs的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致原發(fā)腫瘤向遠(yuǎn)處侵襲與轉(zhuǎn)移。而CCR9在NSCLC患者中檢出率高（33/40，82.5%），提示可通過CTCs檢測CCR9的表達(dá)情況，而不只局限于原發(fā)腫瘤組織學(xué)活檢，CTCs的CCR9有望用作評估NSCLC轉(zhuǎn)移及預(yù)后的新生物學(xué)指標(biāo)。

然而，CTCs在外周血中的數(shù)量十分稀少，檢測費用相對高價亦影響著CTCs檢測技術(shù)的推廣。本研究發(fā)現(xiàn)了CTCs及其CCR9表達(dá)在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移預(yù)測中的潛能，但小樣本量的研究存在著推廣的局限性，故今后將繼續(xù)收集更多NSCLC患者信息，同時將對CTCs在NSCLC治療療效監(jiān)測、分子分型及耐藥基因突變檢測等領(lǐng)域中的研究展開工作。