銅綠微囊藻增殖與產(chǎn)毒過程中的氮磷限制與主控因子研究

任夢(mèng)甜，陳 榮，雷 振，薛 濤，王曉江

(西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西 西安 710055)

以上研究多集中于單一形態(tài)的氮在磷充足的情況下對(duì)藻細(xì)胞增殖和產(chǎn)毒的影響，而對(duì)不同形態(tài)的氮在不同氮磷濃度下對(duì)藻類生長和產(chǎn)毒的影響研究較少。本研究通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，針對(duì)不同形態(tài)的氮在不同氮磷濃度下，氮、磷及其形態(tài)對(duì)微囊藻生長和產(chǎn)毒的影響進(jìn)行研究，以期揭示氮磷源對(duì)微囊藻生長和產(chǎn)毒的影響機(jī)理，確定氮磷在藻類增殖和產(chǎn)毒素過程中的主控因子。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藻種

試驗(yàn)采用藻種為銅綠微囊藻，購于中國科學(xué)院水生生物研究所的淡水藻種庫。開始試驗(yàn)之前，將銅綠微囊藻在對(duì)數(shù)期反復(fù)接種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2 培養(yǎng)條件的設(shè)定

1.3 預(yù)培養(yǎng)、饑餓處理及接種

取適量的藻種，將其接種到新配置的BG-11培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d得到對(duì)數(shù)期藻種。將此對(duì)數(shù)期的藻種進(jìn)行去除營養(yǎng)物質(zhì)處理，6 000 r/min離心10 min，倒掉上清液后用15 mg/L的NaHCO3洗滌3次后保留離心得到的藻細(xì)胞，后接種至不含氮、磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d。饑餓處理后按前述方法再次去除營養(yǎng)物質(zhì)，接入配置的不同氮磷濃度梯度的培養(yǎng)基中，初始接種濃度為2×105個(gè)/mL，pH=7.1。培養(yǎng)周期一般在12～18 d。試驗(yàn)過程中每天搖晃培養(yǎng)液3次，期間改變各組別培養(yǎng)位置，以盡量減少光照對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。為確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究中所有樣品均設(shè)2個(gè)平行樣。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

藻密度的測(cè)定采用細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀(Cellometer Auto T4，達(dá)科為，中國)，該細(xì)胞計(jì)數(shù)儀相比人工計(jì)數(shù)法能根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)辨別細(xì)胞是否死亡，可以較準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)。每次測(cè)定取樣量為1 mL，從接種第2天開始測(cè)定，每隔1 d測(cè)定一次。

藻毒素(細(xì)胞內(nèi))的測(cè)定采用高效液相色譜(LC-2000，日立，日本)，分離柱尺寸為250 mm×4.6mm(SB-C18，安捷倫，USA)。流動(dòng)相為甲醇，磷酸鹽緩沖溶液體積比為0.57∶0.43，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為40 μL。從培養(yǎng)第4天開始每隔3 d測(cè)定一次MC-LR產(chǎn)量。每次取樣量控制在10～25 mL，前期取樣量多，后期逐漸減少。樣品的制備參考Long[21]的制備方法。

比增長率μ是衡量藻類增殖的另一重要參數(shù)，其計(jì)算公式為

μ=ln(Xt/Xt-T)/T

(1)

式中：Xt為第t天的藻密度；Xt-T為第t-T天的藻密度；T為時(shí)間間隔。當(dāng)連續(xù)2 dμ值小于5%時(shí)，藻細(xì)胞增殖停止，試驗(yàn)結(jié)束。

文中所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2007分析，圖均用Origin 9.0繪制。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0，P值表明各組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異，P值越小表示各組數(shù)據(jù)之間的顯著性差異越大。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻細(xì)胞密度

圖1 不同氮磷條件下銅綠微囊藻的最大藻細(xì)胞密度值

2.2 對(duì)數(shù)期的比增長率

圖2 不同氮磷條件下銅綠微囊藻在對(duì)數(shù)期的比增長率

2.3 藻毒素合成

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)結(jié)果，銅綠微囊藻在生長過程中共產(chǎn)生3種MC異構(gòu)體：MC-RR、MC-YR、MC-LR。在本試驗(yàn)的氮磷條件下，各試驗(yàn)組在試驗(yàn)過程中合成的MC-RR含量非常少，幾乎檢測(cè)不到，MC-YR在各組中雖能檢測(cè)到，但只占藻毒素總含量的3%～10%。因此，本試驗(yàn)的氮磷條件下以MC-LR為主導(dǎo)性藻毒素。

圖3 不同培養(yǎng)條件下各培養(yǎng)組的最大MC-LR濃度

2.4 藻細(xì)胞密度與MC-LR的相關(guān)性分析

表1 藻細(xì)胞密度與MC-LR的相關(guān)系數(shù)

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3 結(jié) 論