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    不同光周期和溫度處理下桂花內(nèi)參基因的篩選

    2019-09-25 02:50:16王千千蔣琦妮付建新趙宏波
    關(guān)鍵詞:光周期內(nèi)參桂花

    王千千,蔣琦妮,付建新,董 彬,趙宏波

    (浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院,浙江 杭州,311300)

    桂花Osmanthus fragrans是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一,深受人們喜愛(ài)。不同學(xué)者已經(jīng)從桂花的花芽分化[1-3]、 開(kāi)花機(jī)制[4-5]、 花色呈現(xiàn)[6-7]、 花香釋放[8-9]等不同層面展開(kāi)了研究。 隨著分子水平研究的不斷深入,利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析基因的表達(dá)已成為研究這些過(guò)程機(jī)理的重要手段,而篩選得到適合不同研究的內(nèi)參基因格外重要。研究認(rèn)為[10-11],內(nèi)參基因并不存在通用性,不同處理、不同組織中內(nèi)參基因的表達(dá)水平都會(huì)發(fā)生改變[12];選用一種內(nèi)參基因無(wú)法準(zhǔn)確反映不同植物組織、同一組織不同處理下的基因表達(dá)水平[13-14]。因此,根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)材料和處理?xiàng)l件篩選合適的內(nèi)參基因十分必要[15]。光周期和溫度處理能對(duì)桂花的基因表達(dá)水平、花芽分化進(jìn)程等產(chǎn)生影響。研究表明[4,16]:長(zhǎng)日照和相對(duì)低溫都能夠加快桂花花芽分化進(jìn)程,而短日照條件下桂花的花芽分化相對(duì)較慢,低溫或高溫都會(huì)抑制桂花的花芽分化。本研究在不同光周期和溫度條件下對(duì)桂花常用的7個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行比較分析,篩選最佳內(nèi)參基因,為后期研究光周期和溫度影響桂花開(kāi)花的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    實(shí)驗(yàn)材料為多年生 ‘佛頂珠’O.fragrans‘Foding Zhu’盆栽植株,種植于浙江農(nóng)林大學(xué)桂花資源圃。設(shè)置4個(gè)處理:長(zhǎng)日照高溫(光照/黑暗=14 h/10 h,26℃),長(zhǎng)日照低溫(光照/黑暗=14 h/10 h,19℃),短日照高溫(光照/黑暗=10 h/14 h,26℃)和短日照低溫(光照/黑暗=10 h/14 h,19℃),光照強(qiáng)度為100%,相對(duì)濕度為60%~80%。實(shí)驗(yàn)材料在上述環(huán)境中培養(yǎng)40 d。處理結(jié)束后從8:00起,每隔4 h取當(dāng)年生枝條的第2片或第3片嫩葉,液氮速凍,放于-80℃保存。

    1.2 方法

    1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 每樣品取50~100 mg,充分研磨后按照RNAprep pure Plant Kit(天根,北京)說(shuō)明書(shū)步驟提取各樣品RNA。通過(guò)紫外分光光度計(jì)和質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA濃度和品質(zhì)。以所提樣品RNA為模板,按照Reverse Transcriptase M-MLV(Takara,大連)說(shuō)明書(shū)合成cDNA第1條鏈,合成后于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 候選內(nèi)參基因的選擇和特異性引物設(shè)計(jì) 從桂花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇肌動(dòng)蛋白基因(OfACT)、延伸因子1α蛋白基因(OfEF1α)、NADP-異檸檬酸脫氫酶基因(OfIDH)、GTP結(jié)合蛋白R(shí)NA1基因(OfRNA1)、β 微管蛋白基因(OfTUB)、 泛素結(jié)合酶 E2 基因(OfUBC2)和 18S 核糖體 RNA 基因(Of18S)[12,17]等7個(gè)使用較多的內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因。采用SYBR greenⅡ熒光染料嵌合法進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選,設(shè)計(jì)候選內(nèi)參基因的引物,通過(guò)Bioxman和Primer Premier 5軟件對(duì)引物進(jìn)行校驗(yàn),并利用Primer-BLAST進(jìn)行檢測(cè)以確認(rèn)引物序列的特異性。選用的引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

    1.2.3 熒光定量PCR分析 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法參考SYBRPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(Takara,大連)試劑盒。采用20.0 μL的反應(yīng)體系:其中雙蒸水 6.4 μL,上下游引物各0.8 μL,cDNA模板2.0 μL,SYBRⅡ熒光染料10.0 μL。反應(yīng)在ABI 7300實(shí)時(shí)PCR儀中進(jìn)行,反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃下預(yù)變性30 s;95℃下反應(yīng) 5 s,60℃反應(yīng) 31 s,共40個(gè)循環(huán);95℃下反應(yīng)15 s,60℃下反應(yīng) 1 min,95℃下反應(yīng)30 s, 60 ℃下反應(yīng) 15 s[17]。 3次生物學(xué)重復(fù)。

    1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用geNorm,NormFinder和BestKeeper軟件分別對(duì)qRT-PCR中所得到樣品的反應(yīng)循環(huán)數(shù)(Ct值)進(jìn)行分析,比較7個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性,并選擇最佳內(nèi)參基因。geNorm軟件以各候選內(nèi)參基因在樣品中的表達(dá)水平為依據(jù),計(jì)算各候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性(M),M值越小越穩(wěn)定;M<1.5時(shí)認(rèn)為是理想內(nèi)參[18-19]。geNorm軟件還可以根據(jù)候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異性分析(Vn/Vn+1)得出最佳內(nèi)參基因的個(gè)數(shù);其中V表示配對(duì)差異值,n表示內(nèi)參基因個(gè)數(shù)。軟件默認(rèn)的(Vn/Vn+1)值為0.15,當(dāng)Vn/Vn+1<0.15時(shí),表明引入的n個(gè)內(nèi)參基因已經(jīng)穩(wěn)定,不需要引入(n+1)內(nèi)參基因,當(dāng)Vn/Vn+1>0.15時(shí),則需要引入(n+1)個(gè)內(nèi)參基因[17,20]。因geNorm軟件最終挑選出2個(gè)或2個(gè)以上的內(nèi)參基因組合來(lái)校正數(shù)據(jù),所以n≥2。為了了解引用1個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,需要通過(guò)NormFinder和BestKeeper軟件做進(jìn)一步分析。NormFinder軟件對(duì)內(nèi)參基因的篩選是基于方差分析的結(jié)果,利用△Ct法計(jì)算候選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定值(S),從而評(píng)估候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性;S越小,基因越穩(wěn)定[21]。BestKeeper軟件通過(guò)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和排序,SD越小,則該基因的穩(wěn)定性越好;若SD>1,則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定[20-21]。最后通過(guò)晝夜節(jié)律基因GI的相對(duì)表達(dá)水平,對(duì)選擇的最佳內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證。

    表1 qRT-PCR相關(guān)內(nèi)參基因引物信息Table 1 List of primers for qRT-PCR

    2 結(jié)果和分析

    2.1 RNA品質(zhì)及引物擴(kuò)增效率檢測(cè)

    提取不同處理桂花樣品的總RNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè),所有樣品總RNA的吸光度值[D(260)/D(280)和D(260)/D(230)]均為1.8~2.1。將所有樣品的cDNA等量混合后作為模板,進(jìn)行普通PCR和定量PCR檢測(cè)。為檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率,設(shè)置6個(gè)cDNA濃度梯度(原液,5-1,5-2,5-3,5-4,5-5原液),根據(jù)qRT-PCR結(jié)果,利用公式E=(10-1/s-1)×100%得出基因的擴(kuò)增效率(表2),其中:E(%)表示擴(kuò)增效率,s表示曲線斜率。經(jīng)計(jì)算,擴(kuò)增效率為95%~110%,相關(guān)系數(shù)為0.993~0.998,符合qRT-PCR的基本要求。

    2.2 候選內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

    根據(jù)擴(kuò)增效率,將各樣品的原始cDNA稀釋50倍后作為模板進(jìn)行qRT-PCR。通過(guò)比較循環(huán)數(shù)(Ct)來(lái)評(píng)估各候選內(nèi)參基因在所有樣品中的轉(zhuǎn)錄水平(表2),候選內(nèi)參基因平均Ct為8.99~28.44,其中Of18S的Ct最小,說(shuō)明平均表達(dá)水平最高;OfTUB最大,說(shuō)明平均表達(dá)水平最低;其他候選內(nèi)參基因平均表達(dá)水平差異則相對(duì)較小。

    2.3 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

    geNorm軟件分析發(fā)現(xiàn)(表3),所有候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值均小于1.5,符合內(nèi)參基因篩選的標(biāo)準(zhǔn);其中OfRAN1和OfIDH的穩(wěn)定值相等且最?。∕=0.347),在不同樣品中表達(dá)最為穩(wěn)定,其次是OfACT基因(M=0.393),Of18S穩(wěn)定值最大(M=0.601),說(shuō)明Of18S表達(dá)穩(wěn)定性最差。對(duì)候選內(nèi)參基因的配對(duì)差異值測(cè)算可知(圖1):V2/3=0.126<0.15,表明引入2個(gè)內(nèi)參基因已經(jīng)穩(wěn)定,無(wú)需引入更多的內(nèi)參基因。geNorm軟件分析結(jié)果表明,最佳候選內(nèi)參基因?yàn)镺fRAN1和OfIDH。

    表2 7個(gè)候選內(nèi)參基因擴(kuò)增參數(shù)Table 2 Amplification parameters of seven candidate reference genes

    NormFinder軟件分析發(fā)現(xiàn),OfRAN1基因的表達(dá)穩(wěn)定性最高,其次是OfIDH,Of18S基因表達(dá)穩(wěn)定最差,與geNorm軟件分析的結(jié)果一致(表3)。BestKeeper軟件的分析結(jié)果顯示(表3),在7個(gè)候選內(nèi)參基因中,OfIDH基因的表達(dá)穩(wěn)定性最高,其次是OfRAN1,Of18S基因的表達(dá)穩(wěn)定性最差。分析結(jié)果盡管與geNorm和NormFinder軟件的結(jié)果有些差異,但最佳候選內(nèi)參基因結(jié)果一致。

    表3 不同軟件分析7個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 Gene expression stability of seven reference genes by different software

    綜合3個(gè)軟件的分析結(jié)果可以得出,不同處理?xiàng)l件下,OfRAN1和OfIDH的表達(dá)穩(wěn)定性均為最高,可作為最佳內(nèi)參基因,而Of18S是表達(dá)穩(wěn)定性最差的基因。

    圖1 geNorm軟件分析候選內(nèi)參基因的配對(duì)差異值Figure 1 Pairwise variationof candidate reference genes as calculated by geNorm

    2.4 桂花GI基因?qū)ψ罴褍?nèi)參基因穩(wěn)定性的驗(yàn)證

    GIGANTEA基因(GI)是光周期途徑的重要調(diào)控基因,其表達(dá)呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律。選用桂花晝夜節(jié)律相關(guān)基因GI對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證,可提高內(nèi)參基因篩選的準(zhǔn)確性,保證最佳內(nèi)參基因?qū)庵芷谕緩交虮磉_(dá)水平的校準(zhǔn)作用。選擇OfRAN1/OfIDH,OfRAN1,OfIDH以及其他候選內(nèi)參基因?qū)I基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行校準(zhǔn)(圖2),結(jié)果顯示:相比其他內(nèi)參基因,不同處理下OfRAN1/OfIDH校準(zhǔn)的GI基因的表達(dá)模式表現(xiàn)為光照條件下積累,黑暗條件下降低的周期性表達(dá),符合GI基因的晝夜表達(dá)規(guī)律。說(shuō)明3個(gè)內(nèi)參基因篩選軟件對(duì)候選內(nèi)參基因篩選的結(jié)果是正確的,即OfRAN1和OfIDH基因可作為桂花不同光周期和溫度處理的最佳內(nèi)參基因。

    3 討論

    熒光定量PCR因其眾多優(yōu)點(diǎn)被廣泛運(yùn)用于基因表達(dá)的研究中,成為量化基因轉(zhuǎn)錄表達(dá),揭示基因表達(dá)規(guī)律的有效方法[22-23];但引用適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因?qū)RT-PCR的結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)是非常必要的[20]。理想內(nèi)參基因在不同組織、不同發(fā)育階段、不同生長(zhǎng)條件下均能穩(wěn)定表達(dá)[17,24],但事實(shí)上并沒(méi)有哪一個(gè)基因能夠滿足所有條件[25]。因此,根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)材料和處理?xiàng)l件,篩選出合適的、特定的內(nèi)參基因是確保實(shí)驗(yàn)成功的必要條件。

    圖2 不同內(nèi)參基因或組合校正桂花不同條件下GI基因的相對(duì)表達(dá)Figure 2 Relative expression levels of GI in different conditions using different reference genes or reference gene combination for normalization

    研究發(fā)現(xiàn)[26]:選用2個(gè)或更多內(nèi)參基因組合可以提高內(nèi)參基因校準(zhǔn)的精確度,弱化單一內(nèi)參基因帶來(lái)的不準(zhǔn)確性。RAN(ras-related nuclear protein)是小G蛋白的一類,在細(xì)胞生理進(jìn)化中起到重要的作用,它的很多同源基因是不同光周期、溫度條件下常用的內(nèi)參基因[12,17]。IDH的同源基因被證實(shí)為不同溫度條件下桉樹(shù)Eucalyptus robusta的最佳內(nèi)參基因[27];ACT和18S同源基因分別可作為不同光周期[28]、溫度條件[29]下大豆Glycine max的內(nèi)參基因;EF1a和TUB基因可作為不同光周期、溫度條件下玉米Zea mays的內(nèi)參基因[30];UBC2的同源基因可作為不同溫度條件下歐芹Petroselinum crispum的內(nèi)參基因[31]。本研究選用了桂花中常用的7個(gè)候選內(nèi)參基因,對(duì)其在不同光周期和溫度處理下嫩葉中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行研究;利用geNorm,NormFinder和BestKeeper等3個(gè)常用于內(nèi)參基因篩選的軟件進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)這7個(gè)候選內(nèi)參基因在所有樣品中表達(dá)穩(wěn)定性的排序基本相同,均顯示OfRAN1和OfIDH基因是最穩(wěn)定的2個(gè)內(nèi)參基因,將兩者進(jìn)行組合可以準(zhǔn)確的校準(zhǔn)不同處理下桂花葉片中目的基因的表達(dá)水平;而Of18S表達(dá)最不穩(wěn)定,在所有實(shí)驗(yàn)材料中都存在較高的表達(dá)豐度,因而不適合作為本研究的內(nèi)參基因。

    光周期和溫度途徑在調(diào)控植物成花過(guò)程中發(fā)揮重要作用。篩選得到的桂花不同光周期和溫度條件下的內(nèi)參基因,能夠?yàn)檠芯抗鸹ㄔ诓煌瑴囟群凸庵芷谔幚項(xiàng)l件下的成花機(jī)制提供參考依據(jù),為了解相關(guān)成花基因表達(dá)模式提供保障。

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