魚卵和仔稚魚鑒定技術(shù)研究進(jìn)展

金雨婷 蔣日進(jìn) 趙進(jìn) 劉志堅(jiān) 管峰

摘要 魚卵和仔稚魚是魚類繁殖的早期幼體形態(tài)，其分布、數(shù)量和種類對于漁業(yè)資源的可持續(xù)發(fā)展和生物學(xué)研究具有重要意義，魚卵和仔稚魚鑒定是這一研究的重要環(huán)節(jié)。魚卵和仔稚魚的鑒定先后歷經(jīng)了形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定兩個(gè)技術(shù)發(fā)展階段。簡述魚卵和仔稚魚鑒定在漁業(yè)資源普查和科學(xué)研究中的重要意義以及2種主要鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展，為魚卵和仔稚魚鑒定研究提供基礎(chǔ)知識。

關(guān)鍵詞 魚卵和仔稚魚;物種鑒定;形態(tài)學(xué);分子鑒定;DNA條形碼

中圖分類號 S917文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0018-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.005

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract Fish eggs and larvae are early juvenile forms of fish reproduction， and their distribution， quantity and species are of great significance for the sustainable development of fishery resources and biological research. And the key part of this study field is species identification of fish eggs and larvae. There had two stages of technological development had been gone in the species identification of fish eggs and larvae， i e morphological identification and molecular identification. In this review， the importance， significance， utilization and progress of fish eggs and larvae species identification in the fishery census and scientific research were focused， the aim is to provide some guidance for fish eggs and larvae study.

Key words Fish eggs and larvae;Species identification;Morphology;Molecular identification;DNA barcoding

基金項(xiàng)目 浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017C32081，2017F50015）。

作者簡介 金雨婷（1996—），女，浙江杭州人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物生物技術(shù)。*通信作者，副教授，博士，從事動(dòng)物生物技術(shù)研究。

收稿日期 2019-03-11

海洋魚類是人類生活甚至生存所需的重要自然資源，歷史記載在2 000多年前人們就開始捕撈并不斷開發(fā)近海的漁業(yè)資源，其為人們直接提供了諸多高營養(yǎng)價(jià)值的食品和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品。海洋漁業(yè)資源中不僅具有可開發(fā)利用價(jià)值較高的動(dòng)物，如海洋魚類、頭足類、甲殼類、貝類等，還有大型藻類和植物資源等，這些資源的利用效率和配置效率直接影響著海洋經(jīng)濟(jì)和生態(tài)的發(fā)展。另一方面，海洋環(huán)境污染和資源的過度開發(fā)導(dǎo)致海洋漁業(yè)資源減少的案例不勝枚舉。例如，浙江舟山漁場的大黃魚、小黃魚、帶魚和烏賊即著名的舟山“四大海產(chǎn)”，近年來捕撈量呈現(xiàn)逐年減少的趨勢[1-3]，甚至大黃魚幾乎絕跡。另一方面，開展人工培育和飼養(yǎng)以保持漁業(yè)資源的可持續(xù)發(fā)展，人工飼養(yǎng)的大黃魚在我國漁業(yè)市場已經(jīng)占據(jù)了一定市場份額[4-5]。而在海洋漁業(yè)的循環(huán)和生態(tài)平衡中，浮游生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，魚卵和仔稚魚又是浮游生物的重要組分，既是能量的消費(fèi)者又是被捕食者，對維持生態(tài)平衡具有重要意義[6]。魚類資源的調(diào)查鑒定是漁業(yè)資源監(jiān)測、生態(tài)學(xué)和生物多樣性研究、魚類產(chǎn)地溯源保護(hù)和漁業(yè)資源開發(fā)利用以及海洋保護(hù)區(qū)建設(shè)的重要前提，而魚卵和仔稚魚的鑒定是魚類資源調(diào)查鑒定的重要基礎(chǔ)。

筆者綜述了魚卵和仔稚魚鑒定在漁業(yè)資源研究中的作用和地位，同時(shí)對形態(tài)學(xué)鑒定和快速發(fā)展的DNA條形碼鑒定技術(shù)做了系統(tǒng)闡述，旨在為魚卵和仔稚魚鑒定研究工作者以及初學(xué)者提供理論基礎(chǔ)。

1 魚卵和仔稚魚鑒定在漁業(yè)資源研究中的地位和作用

魚卵和仔稚魚是魚類繁殖季節(jié)產(chǎn)生后代的一種重要方式，魚類生殖方式多種多樣，多數(shù)卵生為主，也有卵胎生和假胎生的種類。魚類繁殖除了具有嚴(yán)格的季節(jié)性規(guī)律，還有固定的繁殖海域，與水域溫度、水質(zhì)營養(yǎng)、鹽度和浮游生物豐富度等多種指標(biāo)相關(guān)。因此，魚卵和仔稚魚的種類、分布區(qū)域和數(shù)量是海洋環(huán)境監(jiān)測和漁業(yè)資源調(diào)查以及科學(xué)研究的重要指標(biāo)。魚卵和仔魚是漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展的根本，其早期成活率決定了漁業(yè)資源的世代強(qiáng)弱，其數(shù)量直接決定了成魚資源的補(bǔ)充量。我國近年來陸續(xù)開展了江河流域和近海區(qū)域的魚卵和仔稚魚調(diào)查，為了解掌握我國漁業(yè)資源和生物多樣性提供了大量數(shù)據(jù)資料。例如，鄭惠東[7]對福建東山灣海域不同季節(jié)的魚卵和仔稚魚數(shù)量和分布進(jìn)行了調(diào)查，明確了這一海域的魚類分布和生態(tài)類型，也對這一海域的生態(tài)環(huán)境有了更多了解。滸苔藻團(tuán)是魚類產(chǎn)卵的重要場所，陳月華等[8]研究了東海區(qū)域在滸苔藻團(tuán)中魚卵的數(shù)量和種類，可以通過保護(hù)滸苔藻團(tuán)為魚類提供繁殖場所，這一研究為資源恢復(fù)和生態(tài)環(huán)境的平衡維持提供了思路。我國三峽大壩的建設(shè)改變了局部水資源的分配，建成后的調(diào)查表明，磨刀溪是魚類資源最為豐富的支流，鯉魚和鯽魚是主要魚種[9]，為三峽庫區(qū)的漁業(yè)資源保護(hù)和三峽大壩對漁業(yè)資源的影響提供了重要參考。由此可見，魚卵和仔稚魚鑒定在資源調(diào)查、生態(tài)學(xué)研究和生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展研究中都具有重要的社會(huì)價(jià)值和生態(tài)意義，也是當(dāng)今社會(huì)發(fā)展和國家海洋戰(zhàn)略的重要部分。

2 魚卵和仔稚魚鑒定技術(shù)研究概況

魚卵和仔稚魚的鑒定技術(shù)歷經(jīng)了形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定兩個(gè)主要發(fā)展過程，現(xiàn)階段主要以兩者結(jié)合為主，但兩種鑒定技術(shù)在方法上各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中兩者可以相互驗(yàn)證，互為補(bǔ)充，使得鑒定準(zhǔn)確性提高，效率也大大增加。

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)及應(yīng)用

魚卵和仔稚魚的形態(tài)學(xué)鑒定是早期人們對于魚類鑒定的基本手段，主要以形態(tài)觀察比較為主，依據(jù)魚卵和仔稚魚的形態(tài)、大小、卵膜、卵黃、卵周隙、脂肪球、油球、內(nèi)膜、絨毛膜、卵黃間隙和色素及分布等特征對魚卵進(jìn)行鑒定[10-13]，也可通過觀察孵化過程的形態(tài)變化進(jìn)行鑒定[14]，形態(tài)學(xué)鑒定和顯微鏡等成像技術(shù)的發(fā)展密不可分，且隨著現(xiàn)代成像技術(shù)的發(fā)展準(zhǔn)確性也有了更進(jìn)一步的提高。但同時(shí)形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)也受到鑒定人員的經(jīng)驗(yàn)和儀器設(shè)備的制約。另一方面，魚卵和仔稚魚早期發(fā)育階段時(shí)間短，形態(tài)變化復(fù)雜，近緣物種間形態(tài)差異不明顯，有記載可查的資料不超過300種，因此形態(tài)學(xué)鑒定的局限性限制了其在諸多未知魚類鑒定中的應(yīng)用[15]。盡管受到人員經(jīng)驗(yàn)和儀器的制約，但在分子鑒定技術(shù)普遍應(yīng)用之前，形態(tài)學(xué)鑒定在魚類的早期鑒定中一直是一項(xiàng)常規(guī)且普遍應(yīng)用的技術(shù)，現(xiàn)如今形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定技術(shù)互補(bǔ)，二者成為魚卵和仔稚魚現(xiàn)代鑒定方法的主要手段[11，16]。資料報(bào)道，截至2006年已記載描述的大西洋魚類就達(dá)2 235種，但是推測僅有9%的魚類記載了可以用于鑒定的早期形態(tài)特征[17]，不足總量的10%[18];同樣，印度洋-太平洋地區(qū)的仔稚魚形態(tài)研究記錄也不足50%，在很大程度上限制了形態(tài)學(xué)技術(shù)在魚卵和仔稚魚鑒定中的應(yīng)用。同時(shí)，隨著海洋漁業(yè)從業(yè)人員的經(jīng)驗(yàn)減少和人才更替，加上形態(tài)學(xué)鑒定儀器設(shè)備的更新?lián)Q代成本較高，也制約了形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)的推廣普及[16]，盡管如此，形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)在很多魚類資源鑒定中仍發(fā)揮了重要作用。房恩軍[19]和周永東[20]等對渤海和舟山海域魚卵和仔稚魚的調(diào)研顯示，我國這兩個(gè)漁業(yè)主產(chǎn)區(qū)的魚類資源逐漸減少。對福建東山灣海域春夏魚卵和仔稚魚鑒定，明確了這一海域34種魚類的分類關(guān)系、生態(tài)類型以及魚卵的數(shù)量與海水鹽度負(fù)相關(guān)關(guān)系，為海洋資源的合理開發(fā)利用提供了參考依據(jù)[7]，在舌鰨類亞種短吻紅舌鰨分類方面進(jìn)行的形態(tài)學(xué)和分子鑒定的對比驗(yàn)證，為分子鑒定提供了形態(tài)學(xué)證據(jù)[21]。但另一方面，由于魚類發(fā)育過程短，形態(tài)變化復(fù)雜，不同種間形態(tài)差異不明顯，仔稚魚生長期變化快且受到環(huán)境等因素的影響，加上魚卵采集后的保存方法也會(huì)對形態(tài)學(xué)鑒定產(chǎn)生一定影響，這些因素在很大程度上制約了形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)在魚卵和仔稚魚鑒定中的應(yīng)用[13]。在一項(xiàng)對魚卵和仔稚魚五個(gè)實(shí)驗(yàn)室開展的獨(dú)立鑒定對比實(shí)驗(yàn)中，形態(tài)學(xué)鑒定到種的準(zhǔn)確率只有13.5%，況且現(xiàn)代形態(tài)學(xué)鑒定需要借助電鏡掃描、X光等技術(shù)設(shè)備因而也受到儀器制約[22-23]。因此，當(dāng)今形態(tài)學(xué)鑒定在應(yīng)用中往往與分子鑒定相結(jié)合，互為補(bǔ)充。陳永久等[24]在對浙江舟山海域的魚卵鑒定中以形態(tài)學(xué)鑒定作為分子鑒定的初步鑒定手段，即形態(tài)學(xué)鑒定到屬，再用分子鑒定到種。Hofmann[11]等則用形態(tài)學(xué)鑒定為參照，對鱈魚、鯖魚和竹莢魚3種常見經(jīng)濟(jì)魚類DNA條形碼鑒定技術(shù)進(jìn)行評測。隨著分子鑒定的發(fā)展，形態(tài)學(xué)鑒定逐步成為與分子鑒定的輔助和驗(yàn)證手段，尤其在對于一些未知物種的鑒定識別中更是不可或缺的識別手段。黃鎮(zhèn)宇等[25]采用形態(tài)學(xué)測量和DNA條形碼技術(shù)結(jié)合的鑒定技術(shù)對我國鯔科魚類進(jìn)行了分類研究，凸顯了兩種鑒定方法結(jié)合的重要性和必要性?？傊?，形態(tài)學(xué)鑒定是魚卵和仔稚魚鑒定發(fā)展過程中的重要技術(shù)發(fā)展階段，并伴隨著分子鑒定技術(shù)的發(fā)展在不斷革新，并與現(xiàn)代分子鑒定技術(shù)互為補(bǔ)充，在實(shí)際應(yīng)用中具有不可替代的作用。

2.2 分子鑒定技術(shù)及應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和多物種基因組數(shù)據(jù)庫不斷豐富以及測序技術(shù)的發(fā)展，從常見的牛羊等家養(yǎng)動(dòng)物的物種鑒定發(fā)展到依據(jù)基因數(shù)據(jù)庫可以對大量稀有甚至未知物種的鑒定，分子鑒定技術(shù)獲得了快速發(fā)展，如今已有魚類鑒定的專有數(shù)據(jù)庫[26]。物種鑒定的多種分子鑒定技術(shù)中，以DNA條形碼技術(shù)為代表，具有相對簡單且易于掌握操作的優(yōu)點(diǎn)[10-11，27]，基因靶標(biāo)以線粒體COI基因?yàn)榇恚€有基于12S rRNA、16S rRNA和CytB基因鑒定的方法[28-30]，這些技術(shù)基本相似，其大致過程如圖1所示，即收集待測樣品后提取DNA，PCR擴(kuò)增目的基因序列，經(jīng)測序后對序列作對比分析即可鑒定物種。

DNA條形碼技術(shù)始于2003年，2006年首次報(bào)道用于魚卵和仔稚魚的鑒定[31]，隨著該技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)已用于多種動(dòng)物的物種鑒定，在魚卵鑒定中已經(jīng)有了大量的實(shí)踐應(yīng)用[10，23，32-35]，且顯示出比傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的優(yōu)勢[23-24]，尤其在近緣物種鑒別、隱種發(fā)現(xiàn)和自動(dòng)化檢測方面更具有優(yōu)勢。阮瑞等[9]采用DNA條形碼技術(shù)分析確定了三峽大壩消落區(qū)733粒魚卵和108尾仔稚魚的種類，陳月華等[8]也利用這一技術(shù)確定了東海滸苔藻團(tuán)中所產(chǎn)卵魚的種類，劉守海等[15]鑒定了長江入海口的仔稚魚種類，把近緣物種且形態(tài)上難以鑒定的矛尾蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚以及蝦虎魚科的5個(gè)亞種進(jìn)行了分類，提高了仔稚魚鑒定的精確度。張楠等[36]利用DNA條形碼技術(shù)鑒定廣東省江門沿岸海域魚卵為鱸形目和鯡形目并闡明了環(huán)境變化對產(chǎn)卵魚類的影響，為這一海域的魚類保護(hù)和環(huán)境保護(hù)提供了證據(jù)。李淵等[37]在浙江省蒼南海域的仔稚魚中鑒定出一個(gè)形態(tài)學(xué)未能鑒定的物種，顯示出該技術(shù)在物種鑒定中的優(yōu)勢。尤卡坦半島海域的魚卵和仔稚魚形態(tài)學(xué)非常相似，Leyva-Cruz等[10]在該海域的300顆魚卵獲得139條序列，歸類分析屬42個(gè)類群35屬33個(gè)種，其中無齒鯧是第一次在該海域發(fā)現(xiàn)的新物種。Kawakami等[38]用16S rRNA基因?qū)︸R里亞納群島西海域魚卵的分子鑒定中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新種，證明這一海域以加曼氏底鱈、密斑刺鲀和大鱗鱗孔鯛為優(yōu)勢魚種并具有分布差異，為這一海域的魚類保護(hù)和資源開發(fā)利用提供了重要證據(jù)材料。由此可見，DNA條形碼技術(shù)比形態(tài)學(xué)鑒定在發(fā)現(xiàn)新物種、易于掌握和適用的廣泛性方面的優(yōu)勢，但也有其不足的一面，如必須依賴基因數(shù)據(jù)庫，若基因庫中沒有收錄的物種則只能鑒定到近緣物種甚至?xí)霈F(xiàn)錯(cuò)誤。

在鑒定技術(shù)方法上，由于魚卵組織少，傳統(tǒng)方法提取DNA的過程容易造成DNA丟失，而用于DNA條形碼COI基因的引物也有多組，不同引物與樣品DNA的特異性也直接影響到PCR擴(kuò)增效率和測序成功率。對魚卵的鑒定大多使用了Ward等[39]和Folmer[40-41]等報(bào)道的魚類鑒定的引物，包括特異性引物和簡并引物[10，13，15，23，36]，由于這些引物在某些物種的特異性不強(qiáng)也會(huì)影響鑒定成功率（部分60%左右）。基于COI通用引物改造而來的加尾引物采用2對上下游引物組合和M13載體的通用測序引物，彌補(bǔ)了原有COI基因引物擴(kuò)增量的不足[42-44]，還簡化了對引物需要多次組合優(yōu)化的繁瑣過程，大大提高了鑒定成功率[45]，成為魚類物種鑒定優(yōu)先選擇的引物組合[11，28，35，46-47]。DNA條形碼鑒定技術(shù)也在不斷改進(jìn)，已有可以用于鑒定多個(gè)未知物種的宏條形碼技術(shù)，這些不斷發(fā)展的分子鑒定技術(shù)在實(shí)用中和形態(tài)學(xué)鑒定互為補(bǔ)充，使得魚類和仔稚魚鑒定變得越來越更為簡單便捷。

圖1 DNA條形碼鑒定魚卵和仔稚魚基本過程

Fig.1 The basal process of species identification for fish eggs and larvae using DNA barcoding

3 小結(jié)與展望

魚卵和仔稚魚是海洋漁業(yè)資源循環(huán)發(fā)展的儲備和資源補(bǔ)充，其種類鑒定有著重要的生態(tài)學(xué)研究價(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。魚卵和仔稚魚的鑒定歷經(jīng)了形態(tài)學(xué)鑒定的發(fā)展階段，但受到魚卵發(fā)育過程短、形態(tài)變化大和數(shù)據(jù)資料少以及鑒定所需人力物力大，耗時(shí)長等因素的制約而未能在魚類研究中得到普遍應(yīng)用。而近年來發(fā)展起來的DNA鑒定技術(shù)尤其DNA條形碼技術(shù)顯現(xiàn)了諸多的優(yōu)勢，在魚卵鑒定中不受其形態(tài)和發(fā)育階段的影響，加上其諸多優(yōu)勢已經(jīng)在鑒定中廣泛應(yīng)用。這一技術(shù)在發(fā)展中與形態(tài)學(xué)鑒定互為補(bǔ)充，隨著測序技術(shù)發(fā)展、物種數(shù)據(jù)庫的完善和數(shù)字PCR以及前處理技術(shù)的發(fā)展，相信在漁業(yè)資源的鑒定中會(huì)發(fā)揮越來越大的作用。

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