重組抗CD25人源化單克隆抗體結(jié)合活性測(cè)定法的建立及方法驗(yàn)證

翟志慧 梅彩英 王曉聞

摘 要 目的：建立重組抗CD25人源化單克隆抗體結(jié)合活性測(cè)定法并對(duì)其進(jìn)行方法驗(yàn)證。方法：采用間接ELISA法建立抗原-抗體-二抗結(jié)合反應(yīng)體系，用四參數(shù)計(jì)算法擬合其結(jié)合曲線，計(jì)算供試品的結(jié)合活性。結(jié)果：方法具有良好的專(zhuān)屬性、精密度、相對(duì)準(zhǔn)確度、線性和耐用性。在64%～156%水平范圍內(nèi)，精密度驗(yàn)證各水平的GCV值均在15%以內(nèi)；相對(duì)準(zhǔn)確度驗(yàn)證各水平的相對(duì)偏倚置信區(qū)間均在±12%范圍內(nèi)，平均回收率均在80%～120%范圍內(nèi)；以五個(gè)水平實(shí)測(cè)值對(duì)數(shù)值對(duì)每個(gè)理論值對(duì)數(shù)值進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系良好。結(jié)論：該方法專(zhuān)屬性好，精密度好，準(zhǔn)確度高，可用于重組抗CD25人源化單克隆抗體結(jié)合活性的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 抗CD25人源化單克隆抗體 結(jié)合活性 驗(yàn)證

中圖分類(lèi)號(hào)：R967 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）15-0097-06

Establishment and validation of a method for the determination of the binding activity of recombinant anti-CD25 humanized monoclonal antibody

ZHAI Zhihui*， MEI Caiying， WANG Xiaowen

（Sansheng Guojian Pharmaceutical （Shanghai） Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： A method for determination of binding activity of recombinant anti-CD25 humanized monoclonal antibody was established and verified. Methods： An antigen-antibody-secondary antibody binding reaction system was established by indirect ELISA and four-parameter method was used to fit the binding curve and calculate the binding activity of samples. Results： The method has a good specificity， precision， relative accuracy， linearity and robustness. In the range of 64%-156%， the GCV values of each level were within 15% for precision validation， the confidence intervals of relative bias of each level were within ±12% for relative accuracy validation， and the average recovery rates were within 80%-120%， the linear regression of each theoretical log value with the measured log values at five levels showed a good linear relationship. Conclusion： The method has a good specificity， precision and accuracy， which can be used to determine the binding activity of recombinant anti-CD25 humanized monoclonal antibody.

KEy WORDS anti-CD25 humanized monoclonal antibody； binding activity； validation

急性排斥反應(yīng)仍是器官移植術(shù)后導(dǎo)致移植物失功的重要危險(xiǎn)因素，也是不良預(yù)后的一個(gè)重要影響因素[1-2]。T細(xì)胞的激活在急性排斥反應(yīng)中處于中心角色，所以現(xiàn)在免疫抑制治療的目標(biāo)就是阻止T細(xì)胞的激活、聚集和發(fā)揮作用[3]。目前已證實(shí)，激活的T細(xì)胞可表達(dá)不同結(jié)構(gòu)和數(shù)量的IL-2R[4]。

IL-2R由α鏈（CD25、Tac、P55）、β鏈（CD122、P70、P75）和γ鏈（CD132、P64）三個(gè)亞基組成。單獨(dú)的α鏈只能構(gòu)成低親和力受體；β和γ鏈則能構(gòu)成中等親和力受體；只有三者的聚合體才能構(gòu)成完整的高親和力受體。高親和力受體是T細(xì)胞增殖反應(yīng)的關(guān)鍵，也是殺傷性T細(xì)胞增殖分化的必需因子。高親和力受體的形成必須依賴(lài)IL-2Rα鏈（CD25）的參與[5-6]：IL-2Rα鏈并不轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，而是負(fù)責(zé)IL-2與IL-2R β鏈、γ鏈異二聚化，激活酪氨酸激酶Jak3，啟動(dòng)STAT分子上的Stat3、Stat5a和5b進(jìn)入受體開(kāi)始磷酸化[7]，從而使抗原激活的T細(xì)胞開(kāi)始有絲分裂和克隆擴(kuò)增。

抗CD25的藥物主要有重組IL-2蛋白[8-9]、抗CD25單克隆抗體（basiliximab、daclizumab）、抗CD25放射免疫結(jié)合物（131I-basiliximab[10]、90Y-daclizumab[11]）、抗CD25免疫毒素（LMB-2[12]、OntakTM[13]、E7777[14]）、抗CD25抗體藥物偶聯(lián)物（ADCT-301）等[15]。臨床資料表明，抗CD25單克隆抗體作為新的免疫抑制劑的代表，特異性地作用于CD25，通過(guò)阻斷T細(xì)胞的活化與增殖，能夠有效降低急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，顯著提高移植物及移植受體的生存率，降低激素用量和縮短其使用時(shí)間[16]。

本公司生產(chǎn)的重組抗CD25人源化單克隆抗體注射液（健尼哌），是羅氏公司生產(chǎn)的賽呢派（daclizumab，zenapax）的生物類(lèi)似藥，其作用機(jī)制是通過(guò)與抗原CD25的特異結(jié)合而發(fā)揮作用的?！吨袊?guó)藥典》2015版三部“人用重組單克隆抗體制品總論”中對(duì)效價(jià)的檢定包括生物學(xué)活性和結(jié)合活性兩個(gè)檢項(xiàng)。因此，結(jié)合活性是產(chǎn)品重要的質(zhì)控指標(biāo)。本研究采用間接ELISA法測(cè)定重組抗CD25人源化單克隆抗體與抗原CD25的結(jié)合活性，并參考USP通則<1033>（Biological Assay Validation），對(duì)該方法進(jìn)行方法驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 參比品及供試品

參比品及供試品重組抗CD25人源化單克隆抗體理化對(duì)照品（簡(jiǎn)稱(chēng)002理化對(duì)照品，批號(hào)：S20110301）、空白輔料重組抗CD25人源化單克隆抗體原液緩沖液（簡(jiǎn)稱(chēng)002原液緩沖液，批號(hào)：180703）和其他IgG單抗重組抗HER2人源化單克隆抗體理化對(duì)照品（簡(jiǎn)稱(chēng)302理化對(duì)照品，批號(hào)：S200901）均由本公司提供。

1.2 試劑及儀器

CD25蛋白為北京義翹神州生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Goat anti-Human IgG（Fc specific）-HRP為Sigma公司產(chǎn)品；EL-TMB顯色試劑盒為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀及SoftMax分析軟件為美國(guó)Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.3 測(cè)定方法

將CD25蛋白用包被液稀釋至0.1 mg/ml，包被酶標(biāo)板，100 ml/孔，2～8 ℃過(guò)夜；用洗滌液洗板4次；用封閉液（含3% BSA的PBS緩沖液）300 ml/孔，25 ℃孵育2 h；用洗滌液洗板4次；用稀釋液將重組抗CD25人源化單克隆抗體參比品及供試品分別稀釋至2 500 ng/ml，再3倍比稀釋10個(gè)濃度梯度達(dá)833.33、277.78、92.59、30.86、10.29、3.43、1.14、0.38、0.13和0.04 ng/ml，共11個(gè)濃度點(diǎn)。分別將稀釋后的參比品和供試品100 ml/孔加入酶標(biāo)板中，25 ℃孵育2 h；用洗滌液洗板4次；加入二抗Goat anti-Human IgG （Fc specific）-HRP（1 ： 20 000），100 ml/孔，25 ℃孵育1 h；用洗滌液洗板4次；加入新配的TMB顯色液，100 ml/孔，室溫避光顯色15～25 min，加入終止液50 ml/孔，于酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm參比波長(zhǎng)650 nm處讀取各孔吸收度（A）值，利用Softmax軟件分析數(shù)據(jù)，以重組抗CD25人源化單克隆抗體蛋白濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的A450-650吸光度均值為縱坐標(biāo)，用四參數(shù)方程繪制劑量反應(yīng)曲線。根據(jù)供試品及參比品的半數(shù)有效濃度（EC50），按以下公式計(jì)算供試品的相對(duì)結(jié)合活性。以參比品及供試品曲線的系數(shù)R2≥0.98，信噪比≥10，參比品與供試品的曲線斜率的比值在80%～120%之間，檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)（CV）不超過(guò)20%，作為試驗(yàn)成立的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 專(zhuān)屬性

將002理化對(duì)照品用65 ℃水浴處理4 h作為強(qiáng)制破壞樣本。取002理化對(duì)照品、002原液緩沖液、302理化對(duì)照品和強(qiáng)制破壞樣本（65 ℃水浴處理4 h）按照上述測(cè)定方法進(jìn)行相對(duì)結(jié)合活性測(cè)定，驗(yàn)證該方法的專(zhuān)屬性。002理化對(duì)照品應(yīng)有顯著的量效曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合圖應(yīng)呈“S”曲線；002原液緩沖液和302理化對(duì)照品應(yīng)無(wú)量效曲線；強(qiáng)制破壞樣品的結(jié)合活性相對(duì)于參比品應(yīng)呈下降趨勢(shì)。

1.4.2 精密度

由2名實(shí)驗(yàn)人員，在3個(gè)不同的工作日內(nèi)，對(duì)002理化對(duì)照品按照上述測(cè)定方法進(jìn)行相對(duì)結(jié)合活性測(cè)定。其中實(shí)驗(yàn)人員1每天制備5個(gè)水平的供試品，相對(duì)結(jié)合活性分別是參比品的64%、80%、100%、125%和156%；實(shí)驗(yàn)人員2每天制備3個(gè)水平的供試品，相對(duì)結(jié)合活性分別是參比品的64%、100%和156%。2名實(shí)驗(yàn)人員每個(gè)水平的供試品需獨(dú)立制備兩份，在同一塊板上進(jìn)行測(cè)定。參比品和供試品均以雙孔結(jié)果進(jìn)行擬合作為一次結(jié)果，將各個(gè)水平的實(shí)測(cè)原始值取對(duì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)水平的對(duì)數(shù)平均值、對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）、幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差（GSD）、幾何變異系數(shù)（GCV）、對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差95%置信上限（CISD）、幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差95%置信上限（CIGSD）、幾何變異系數(shù)95%置信上限（CIGCV）。以每一水平的幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差和幾何變異系數(shù)來(lái)驗(yàn)證該方法的精密度。GCV應(yīng)≤15%。

1.4.4 線性與范圍

以相對(duì)準(zhǔn)確度驗(yàn)證中的5個(gè)水平實(shí)測(cè)值對(duì)數(shù)值（縱坐標(biāo)）對(duì)每個(gè)理論值對(duì)數(shù)值（橫坐標(biāo)）作圖，評(píng)估相對(duì)結(jié)合活性的實(shí)測(cè)值對(duì)數(shù)值與理論值對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系。用直線回歸方程、方程斜率和回歸系數(shù)來(lái)驗(yàn)證該方法的線性。直線回歸方程斜率應(yīng)在1.00±0.15，R2應(yīng)≥0.95。

符合相對(duì)準(zhǔn)確度、精密度和線性要求時(shí)的活性水平即為該方法的范圍。

1.4.5 耐用性

1.4.5.1 抗原包被濃度

由同一實(shí)驗(yàn)人員，采用120、100和80 ng/ml 3種抗原包被濃度，按照上述測(cè)定方法測(cè)定002理化對(duì)照品的相對(duì)結(jié)合活性。每種濃度包被1塊酶標(biāo)板，每塊板制備1份參比品和2份100%水平的供試品，參比品和供試品均以復(fù)孔結(jié)果進(jìn)行擬合作為一次結(jié)果，統(tǒng)計(jì)6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD。RSD應(yīng)≤15%。

1.4.5.2 TMB顯色時(shí)間

由同一實(shí)驗(yàn)人員，將TMB顯色時(shí)間分別設(shè)置15、20和25 min，按照上述測(cè)定方法測(cè)定002理化對(duì)照品的相對(duì)結(jié)合活性。每個(gè)TMB顯色時(shí)間1塊酶標(biāo)板，每塊板制備1份參比品和2份100%水平的供試品，參比品和供試品均以復(fù)孔結(jié)果進(jìn)行擬合作為一次結(jié)果，統(tǒng)計(jì)6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD。RSD應(yīng)≤15%。

2 結(jié)果

2.1 方法的專(zhuān)屬性驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，002理化對(duì)照品有顯著的量效曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合圖呈“S”曲線；002原液緩沖液和302理化對(duì)照品無(wú)量效曲線（圖1）。強(qiáng)制破壞樣本的相對(duì)結(jié)合活性為71%，相對(duì)于參比品呈下降趨勢(shì)（圖2，表1）。

2.2 方法的精密度驗(yàn)證

對(duì)精密度驗(yàn)證的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，各水平的GCV值均在15%以內(nèi)，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，證明該方法精密度良好（表2，表3）。

2.3 方法的相對(duì)準(zhǔn)確度驗(yàn)證

對(duì)相對(duì)準(zhǔn)確度驗(yàn)證的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，各個(gè)水平的相對(duì)偏倚置信區(qū)間均在±12%范圍內(nèi)（表4），各個(gè)水平的平均回收率均在80%～120%范圍內(nèi)（表5）。兩種評(píng)判方法的相對(duì)準(zhǔn)確度指標(biāo)均符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，證明該方法相對(duì)準(zhǔn)確度良好。

2.4 方法的線性與范圍驗(yàn)證

以相對(duì)準(zhǔn)確度驗(yàn)證中的5個(gè)水平實(shí)測(cè)值對(duì)數(shù)值（縱坐標(biāo)）對(duì)每個(gè)理論值對(duì)數(shù)值（橫坐標(biāo)）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=1.042 2x+0.006 5，方程斜率在1.00±0.15范圍內(nèi)；回歸系數(shù)R2=0.990 8，不小于0.95。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在64%～156%水平范圍內(nèi)，該方法的線性關(guān)系良好。

2.5 方法的耐用性驗(yàn)證

耐用性驗(yàn)證結(jié)果表明，兩組實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是2.9%和2.5%（表6，表7），說(shuō)明方法的耐用性良好。

3 討論

抗體藥物對(duì)效價(jià)的評(píng)價(jià)主要包括結(jié)合活性測(cè)定和生物學(xué)活性測(cè)定。生物學(xué)活性測(cè)定方法主要包括基于細(xì)胞的生物活性測(cè)定方法（細(xì)胞增殖抑制法、細(xì)胞毒性法、補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性法、抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性法、細(xì)胞ELISA法等）、基于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生物活性測(cè)定方法及基于新技術(shù)的生物學(xué)活性測(cè)定方法（表面等離子共振效價(jià)測(cè)定法、均相時(shí)間分辨熒光、Alpha技術(shù)、熒光染料標(biāo)記法）[17]。由于我司的重組抗CD25人源化單克隆抗體注射液（健尼哌）2011年就已經(jīng)批準(zhǔn)上市，當(dāng)時(shí)并沒(méi)有開(kāi)發(fā)出一個(gè)操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、變異度小的生物學(xué)活性方法用于產(chǎn)品的批放行，而是用細(xì)胞膜表面表達(dá)CD25的人T淋巴瘤細(xì)胞系HUT-102作為靶細(xì)胞，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)抗CD25抗體與抗原CD25親和力的方法作為產(chǎn)品的批放行檢測(cè)方法。該方法操作繁瑣、準(zhǔn)確性差、變異度大，而且只能反映抗CD25抗體與細(xì)胞膜表面CD25之間的親和力，并不能真正反映抗體在體內(nèi)的作用機(jī)制，因此可以用操作簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠的間接ELISA法代替。當(dāng)然，結(jié)合活性測(cè)定方法只能評(píng)價(jià)抗體藥物與靶點(diǎn)分子在體外的相對(duì)親和力，當(dāng)前評(píng)價(jià)藥效最常用的生物學(xué)活性測(cè)定方法應(yīng)是開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生物活性測(cè)定方法。因此，后續(xù)計(jì)劃構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程細(xì)胞株，開(kāi)發(fā)一個(gè)操作簡(jiǎn)便、周期短、特異性好、變異度小的報(bào)告基因法用于產(chǎn)品批放行的生物學(xué)活性測(cè)定。

生物制品質(zhì)量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物學(xué)測(cè)定方法。理化分析方法的驗(yàn)證與化學(xué)藥品基本相同，可參照《中國(guó)藥典》2015版三部通則<9101>“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行，在具體驗(yàn)證時(shí)需要結(jié)合生物制品的特點(diǎn)具體考慮。而生物學(xué)測(cè)定方法相對(duì)于理化分析方法而言，存在更多的影響因素，由于通則<9101>并不涉及生物學(xué)測(cè)定方法驗(yàn)證的內(nèi)容，目前國(guó)內(nèi)可參考的只有藥品審評(píng)中心發(fā)布的“生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)審評(píng)一般原則”，但此原則尚未在生物學(xué)活性測(cè)定的基礎(chǔ)上對(duì)方法驗(yàn)證參數(shù)的含義和適用性進(jìn)行清楚的闡述。而USP通則<1033>則是從生物學(xué)活性測(cè)定的角度來(lái)闡明生物檢定方法的驗(yàn)證。因此，本文參考USP通則<1033>進(jìn)行了方法驗(yàn)證。

方法驗(yàn)證結(jié)果顯示方法的專(zhuān)屬性、精密度、相對(duì)準(zhǔn)確度以及線性與范圍各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到方法驗(yàn)證的要求。因此本方法可用于重組抗CD25人源化單克隆抗體結(jié)合活性的測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

[1] Asberg A， Midtvedt K， Line PD， et al. Calcineurin inhibitor avoidance with daclizumab， mycophenolate mofetil， and prednisolone in DR-matched de novo kidney transplant recipients[J]. Transplantation， 2006， 82（1）： 62-68.