連榆燒傷膏無菌檢查方法適用性研究

陳煒偉 譚琴 姚仲青 周丹 楊天喜

摘 要 目的：建立連榆燒傷膏無菌檢查的方法。方法：按《中國藥典》2015年版，采用薄膜過濾法進行方法適用性試驗。結(jié)果：驗證試驗中各菌株與陽性對照菌生長同步，而陰性對照沒有菌生長。結(jié)論：采用該方法對連榆燒傷膏進行無菌檢查，方法可行、有效。

關(guān)鍵詞 連榆燒傷膏 無菌檢查 方法適用性

中圖分類號：R927.11； R982 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）15-0120-03

Applicability of the sterility test method for Lianyushaoshang ointment

CHEN Weiwei*， TAN Qin， YAO Zhongqing， ZHOU Dan， YANG Tianxi

（Yangzi River Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Jiangsu Taizhou 225321， China）

ABSTRACT Objective： To establish a standard for the sterility test of Lianyushaoshang ointment. Methods： The sterility tests of Lianyushaoshang ointment were performed by membrane-filtration procedure based on Chinese pharmacopoeia（2015）. Results： The growth of strains synchronized with the bacteria in positive control in the verification test and there was no bacterium growth in negative control. Conclusion： The method for the sterility test of the Lianyushaoshang ointment is feasible and effective.

KEy WORDS Lianyushaoshang ointment； sterility test； applicability test

連榆燒傷膏由黃連、地榆、當歸等中藥組成，具有清熱解毒，生肌止痛的功效，用于淺、深Ⅱ度燒、燙傷創(chuàng)面的治療。根據(jù)《中國藥典》2015版[1]通則規(guī)定，需對本品進行無菌檢查。該制劑為油脂型基質(zhì)，需對供試品進行適當?shù)奶幚矸侥苓M行檢查。中藥外用制劑的無菌檢查報道較少[2-4]，且多為參照《中國藥典》2010年版建立的方法[5]。本試驗通過參考《中國藥典》2015年版及相關(guān)文獻[6-9]，建立并驗證連榆燒傷膏的無菌檢查法，為藥品的生產(chǎn)和檢驗提供可行、有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品

連榆燒傷膏（批號18011811、18011911、18011912，揚子江藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)）。

1.2 菌種

大腸埃希菌（CMCC（B）44102-XM-D04）；金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003-XM-D04）；枯草芽胞桿菌（CMCC（B）63501-XM-D04）；生孢梭菌（CMCC（B）64941-YT-D04）；白色假絲酵母（CMCC（F）98001-XM-D04）；黑曲霉（CMCC（F）98003-XM-D02）。以上菌種均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 培養(yǎng)基、試劑及稀釋液

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號20161216）和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號20170908），購自北京奧博星生物科技有限責任公司；十四烷酸異丙酯（批號20151125）、聚山梨酯80（批號20170329），購自國藥集團化學試劑有限公司；pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號17020641），揚子江藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)。

1.4 儀器

XG1.DTX-0.36脈動真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；1300A2生物安全柜（賽默飛世爾有限公司）；LRH250生化培養(yǎng)箱（上海索譜儀器廠）；HTY-602集菌儀（浙江泰林生物技術(shù)設備有限公司）；KSF330全封閉集菌培養(yǎng)器（浙江泰林生物技術(shù)設備有限公司）；PhoenixSpec濁度儀（碧迪醫(yī)療器械有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 菌液制備

參照《中國藥典》2015版四部附錄1101無菌檢查法項下方法[1]，分別制得每1 ml含菌數(shù)不大于100 cfu的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母、生孢梭菌、黑曲霉菌懸液。

1.5.2 供試液制備

取供試品10支，每支取約3 g，置一滅菌錐形瓶中，加入無菌十四烷酸異丙酯30 ml，玻璃棒攪拌使其溶解。然后加至含200 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的滅菌分液漏斗中，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液。平行制備兩份。

1.5.3 方法適用性試驗

試驗組中每支集菌培養(yǎng)器先用50 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤膜。潤膜后，將供試液抽入一套集菌培養(yǎng)器內(nèi)，過濾。然后用含0.1%聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每張濾膜的沖洗量為300 ml，每次沖洗100 ml，在最后一次沖洗液中分別加入各試驗菌菌懸液1 ml。沖洗結(jié)束后在每支培養(yǎng)器中加入100 ml培養(yǎng)基（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、生孢梭菌：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母、黑曲霉：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）。

陽性對照組向每支集菌培養(yǎng)器中分別加入50 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，再分別加入各試驗菌懸液1 ml，過濾。過濾結(jié)束后同上在每支培養(yǎng)器中加入100 ml培養(yǎng)基。

陰性對照組分別在兩支培養(yǎng)器中直接加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基各100 ml。

1.5.4 培養(yǎng)條件

裝有硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器置于32 ℃培養(yǎng)14 d，裝有胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器置于23 ℃培養(yǎng)14 d；逐日觀察，比較對照組與試驗組各試驗菌的生長情況。

2 結(jié)果

通過三批次的驗證（表1），各菌株試驗組與陽性對照生長同步無明顯差異，陰性對照無菌生長，說明此方法可行。

3 討論

連榆燒傷膏為非水溶性軟膏，本品使用蜂蠟及香油作為基質(zhì)，需使用十四烷酸異丙酯使軟膏分散溶解，并加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液萃取，取下層水相作為供試液。筆者考察了供試液的制備方法，參考藥典取樣標準，取30 g供試品，分別以軟膏-十四烷酸異丙酯（1∶0.5、1∶1、1∶2）分散溶解，再以200 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液萃取，1∶0.5試驗組溶液黏稠，分散不均勻；1∶2試驗組萃取時乳化不分層。最終選擇取10支，每支3 g，加入30 ml十四烷酸異丙酯溶解，再以200 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液萃取，分層效果好，易于操作。

中藥半固體制劑由于基質(zhì)特殊，成分復雜，往往存在抑菌作用，建立無菌檢查方法時需要消除供試品的抑菌性。本試驗中，黃連中的異喹啉類生物堿、地榆中的鞣質(zhì)都有不同程度的抑菌作用[10-13]，一些溶解性較差的成分在萃取時會一同進入水相，在過濾操作中被濾膜截留，同時供試液中殘留油脂類成分，在培養(yǎng)過程中會對觀察造成干擾。因此選擇在沖洗液中加入0.1%的聚山梨酯80[14]，并選擇每張濾膜沖洗300 ml，每次100 ml的沖洗量，降低抑菌成分及油脂類成分在膜上的吸附，雖然濾膜上仍殘留不溶性粉末，但不影響結(jié)果的判斷。

目前，中藥制劑進行無菌檢查的品種較少，除注射劑外，僅有部分用于嚴重創(chuàng)傷、燒傷的軟膏劑、乳膏劑及眼用制劑需進行無菌檢查[15]。對于創(chuàng)傷、燒傷的制劑，原則上都應符合無菌檢查的要求，然而一些已批準上市的品種，出于原輔料控制、工藝改造等原因，仍舊執(zhí)行微生物限度檢查，反映了我國中藥質(zhì)量標準相對落后，還需進一步提升和規(guī)范。本文所述方法對中藥軟膏劑無菌檢查方法的研究提供了一定的參考價值。

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