均勻設(shè)計法優(yōu)化林下山參中人參皂苷提取工藝的研究

張艷欣 朱國琴 王丹丹

摘 要 目的：優(yōu)選林下山參中人參皂苷的提取工藝。方法：以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd的提取量以及HPLC色譜峰個數(shù)為考察指標(biāo)，對提取過程中甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取溫度進(jìn)行考察，采用均勻設(shè)計法進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果：篩選得到最優(yōu)提取工藝條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度50 ℃，提取時間100 min。在此條件下可使人參皂苷的提取量最高、色譜峰個數(shù)最多。結(jié)論：所建立的優(yōu)化工藝可大大提高提取效率，為林下山參人參皂苷的提取研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 林下山參 人參皂苷 均勻設(shè)計

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）15-0089-04

Optimization of extraction process of ginsenosides from mountain-cultivated ginseng

ZHANG Yanxin1，2*， ZHU Guoqin2， WANG Dandan2**

（1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 2. SPH Xing Ling Science & Technology Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201703， China）

ABSTRACT Objective： To optimize the extraction process of ginsenosides from mountain-cultivated ginseng. Methods： The extraction amount of ginsenoside Rg1， Re， Rb1， Rc and Rd and the number of HPLC peaks were taken as indicators， the methanol volume fraction， extraction time and extraction temperature in the extraction process were investigated， and finally the extraction process was optimized by the uniform design method. Results： The optimal extraction conditions were as follows： methanol volume fraction 70%， extraction temperature 50 ℃， extraction time 100 min. The highest amount of ginsenosides could be extracted and the more chromatographic peaks could be obtained under these conditions. Conclusion： The yields of ginsenosides can be greatly improved under the optimal condition and this method can provide a reference for extraction of ginsenosides from mountain-cultivated ginseng.

KEy WORDS mountain-cultivated ginseng； ginsenoside； uniform design

林下山參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根莖，是一味常見的名貴中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，認(rèn)為其具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺、安神益智等功效，在現(xiàn)代臨床藥理研究表明，人參能夠在提升免疫力[1-2]、抗腫瘤[3-4]、改善心血管[5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]、抗老年癡呆[8]、降血糖[9]、抑菌抗炎[10]等多個方面發(fā)揮顯著作用，而其主要藥效成分就是人參皂苷。

對于林下山參中人參皂苷的提取方法多有報道[11-13]，但未見采用均勻設(shè)計方法的相關(guān)研究。均勻設(shè)計是基于數(shù)論方法推導(dǎo)出來的一種實驗設(shè)計方法，與試驗次數(shù)等于實驗因子數(shù)平方的正交設(shè)計實驗相比，它的試驗次數(shù)為最大水平數(shù)，大大減小了工作量。處理方法多采用多重現(xiàn)性回歸的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。本研究以《中國藥典》2015版對林下山參含量測定限定成分和含量較多的成分人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd含量及色譜峰個數(shù)為評價指標(biāo)，以期反映林下山參總皂苷提取效率。采用均勻設(shè)計法考察甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度對超聲提取工藝的影響，并對提取效果進(jìn)行驗證，提高了提取效率，有利于特有微量成分的提取，提高林下山參利用率，為林下山參提取工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

HPLC液相系統(tǒng)：Waters Acquity ARC高效液相色譜系統(tǒng)，配有Empover軟件，四元溶劑系統(tǒng)、自動進(jìn)樣管理器、柱溫箱、PDA 檢測器；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；EYELA CCA-1112型冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司）；Sartorius BS 124S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；Sartorius SQPQUINTIX65-1CN 1/10分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 試藥

甲酸（分析純，上海豪申化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；實驗用水為娃哈哈純凈水。

實驗用標(biāo)準(zhǔn)品：人參皂苷Rg1（批號Z1308L45576，含量以99.7%計），人參皂苷Re（批號B10M8S35243，含量以99.2%計），人參皂苷Rb1（批號Z16J9X52719，含量以99.9%計），人參皂苷Rc（批號M18J9S53098，含量以98.8%計），人參皂苷Rd（批號Z13N8X48155，含量以99.6%計），購自上海源葉生物科技有限公司。實驗用林下山參粉末（批號150917）由上海上藥神象健康藥業(yè)有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件的建立

色譜柱：Waters CORTECS C18（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動相A：0.1%甲酸水，流動相B：0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 ml/min；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量5 μl。

1.3.2 對照品溶液制備

取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd對照品各5.0 mg，精密稱定，至5 ml量瓶中，用甲醇溶解，定容，制得濃度為1 mg/ml的溶液，搖勻，即得。

1.3.3 供試品溶液制備

取林下山參粉末2.0 g，精密稱定，置25 ml具塞錐形瓶中，加甲醇20.0 ml稱重，于室溫超聲30 min，補足失重，過濾，取續(xù)濾液10.0 ml，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，置2 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，過0.22 μm濾膜，即得。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

人參皂苷Rg1對照品20.0 mg、人參皂苷Re對照品20.0 mg、人參皂苷Rb1對照品20.0 mg、人參皂苷Rc對照品20.0 mg及人參皂苷Rd對照品10.0 mg，置5 ml容量瓶中，甲醇溶液溶解并定容，搖勻，得混合對照品母液，逐級稀釋，得系列混合對照品溶液。在1.3.1項下色譜條件進(jìn)樣，以對照品樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸（表2）。

2.2 方法專屬性試驗

取空白樣品溶液、對照品溶液以及供試品溶液，按1.3.1項下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。

2.3 精密度試驗

取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd混合對照品溶液，按1.3.1項下色譜條件分別重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的含量RSD分別為0、0.55%、0.62%、0.64%、1.48%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Rc對照品及人參皂苷Rd對照品混合對照品溶液，按1.3.1項下色譜條件分別在0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h進(jìn)樣，結(jié)果人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的含量RSD分別為0、0.49%、1.25%、1.11%、0.93%，表明供試品24 h時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗

精密稱定同一批林下山參樣品2.0 g，平行制備5份供試品溶液，按1.3.1項下色譜條件測定，結(jié)果人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd含量的RSD值分別為：0、0.46%、2.23%、2.25%、1.08%。

2.6 加樣回收率試驗

分別精密稱取已測含量的林下山參樣品粉末2.0 g，共6份，分別按含量的50%、100%和150%量加入對應(yīng)量對照品，按1.3.3項下供試品制備方法制備，每個加入量平行制備2份供試品溶液。測定含量，分別計算加樣回收率及RSD值，得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的平均加樣回收率分別為：99.80%、101.23%、99.16%、100.51%、101.31%；RSD分別為1.41%、2.05%、1.30%、 0.50%、1.96%。

3 林下山參提取方法及優(yōu)化

3.1 提取方法的選擇

精密稱定同一批樣品，共6份，2份按照《中國藥典》2015版一部人參提取方法提取，2份超聲30 min提取，2份超聲后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干用甲醇復(fù)溶后提取，以HPLC色譜圖色譜峰的數(shù)量及5種主要人參皂苷的含量為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)超聲提取后旋蒸蒸發(fā)濃縮至干用70%甲醇復(fù)溶提取效果最好，因此本實驗選用該方法來優(yōu)化林下山參中人參皂苷提取工藝。

3.2 單因素考察

為考察超聲提取時間、提取溫度和提取溶劑等因素對人參皂苷提取的影響，進(jìn)行了單因素的試驗考察，單因素結(jié)果最佳提取時間為60 min，最高得分為18.61分；單因素結(jié)果最佳提取溫度為60 ℃，最高得分為19.78分；單因素結(jié)果最佳提取溶劑為70% MeOH，最高得分為23.08。結(jié)果根據(jù)實驗結(jié)果現(xiàn)選定3個影響因素的取值范圍：超聲提取時間為20 min～140 min，提取溫度為20 ℃～80 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)為40%～100%。

3.3 均勻設(shè)計實驗安排及結(jié)果

將超聲提取時間、提取溫度和提取溶劑體積分?jǐn)?shù)確定為3個因素，每個因素等分為7個水平，利用DPS設(shè)計均勻設(shè)計實驗表并進(jìn)行優(yōu)化。各組分別加入不同體積分?jǐn)?shù)甲醇，選取不同提取溫度進(jìn)行不同時間的提取，每個實驗重復(fù)兩次，實驗安排及結(jié)果見表3。