一種pH響應(yīng)型光敏劑的活性和細(xì)胞毒性

鄢樹(shù)楓，黃曉晨，邢建宏，劉希華，張君誠(chéng)

（1.三明學(xué)院 藥用植物開(kāi)發(fā)利用福建省高校工程研究中心，福建 三明365004；2.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院，福建 三明 365004；3.中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所，福建 福州 350002）

當(dāng)前，癌癥仍然是廣泛威脅人類健康的重大疾病之一，每年都造成全世界大量的患者死亡。 針對(duì)癌癥治療，外科手術(shù)治療、放射療法和化學(xué)療法是目前臨床應(yīng)用中傳統(tǒng)的三種方式。 光動(dòng)力療法（Photodynamic Therapy，PDT）是一種新型的腫瘤治療方法，主要是利用光敏劑在有氧條件下被特殊波長(zhǎng)的光激發(fā)后，產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的單線態(tài)氧。 相比于傳統(tǒng)的癌癥治療方式，光動(dòng)力療法是一種微創(chuàng)、幾乎沒(méi)有副作用的新療法。 目前，光動(dòng)力療法已經(jīng)被證實(shí)可作為高效的抗腫瘤治療手段，在科研和臨床上都有較廣泛的探索和應(yīng)用[1-2]。 光動(dòng)力療法的療效主要依賴于光敏劑，不同的光敏劑具有的激發(fā)波長(zhǎng)、單態(tài)氧產(chǎn)率和細(xì)胞毒性等各不相同。 迄今為止，只有少數(shù)幾種光敏劑得到官方批準(zhǔn)上市應(yīng)用[3-5]。 本文在前期化學(xué)合成ZnPc(TAP)4光敏劑的基礎(chǔ)上[6]，進(jìn)一步研究ZnPc(TAP)4光敏劑的光化學(xué)性質(zhì)、單線態(tài)氧產(chǎn)量以及對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的選擇毒性，以期為光動(dòng)力抗腫瘤治療提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑主要購(gòu)買(mǎi)于阿爾法化工有限公司、西格瑪奧德里公司和百靈威公司等。 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞HELF 由中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所提供。DCFH-DA 單線態(tài)氧探針、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、胎牛血清、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液等細(xì)胞相關(guān)試劑和耗材購(gòu)買(mǎi)于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ZnPc(TAP)4光敏劑的pH 靈敏性分析

ZnPc(TAP)4光敏劑中帶有12 個(gè)二甲氨甲基基團(tuán)，對(duì)于溶液的pH 值較敏感。 根據(jù)磷酸鹽緩沖液配方表，配置不同pH 的磷酸鹽緩沖液，將ZnPc(TAP)4光敏劑溶解在相應(yīng)的pH 緩沖液里，再分別用Synergy 4 TM 混合式多功能讀板機(jī)采集各個(gè)孔的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜， 其中熒光檢測(cè)選擇610 nm 波長(zhǎng)激發(fā)，檢測(cè)ZnPc(TAP)4光敏劑在635～900 nm 波段的熒光圖譜。 用軟件繪制不同pH條件下的紫外吸收和熒光圖譜。

磷酸鹽緩沖液配方見(jiàn)表1。母液的配制：0.2 mol/L Na2HPO4： 稱取 71.6 g Na2HPO4-12H2O， 溶 于 1 000 mL 水 ；0.2 mol/L NaH2PO4： 稱 取 31.2 g NaH2PO4-2H2O，溶于 1 000 mL 水。

表1 磷酸鹽緩沖液配方表

1.2.2 不同pH 條件下ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)量

為測(cè)定ZnPc(TAP)4 光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)量情況，選擇2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）為單線態(tài)氧檢測(cè)探針。 體系中有單線態(tài)氧產(chǎn)生時(shí)，DCFH-DA 可轉(zhuǎn)變?yōu)?DCF（2，7-二氯熒光素），DCF 經(jīng)400 nm 波長(zhǎng)光激發(fā)，在528 nm 波長(zhǎng)處有特征熒光產(chǎn)生。 因而，檢測(cè)528 nm 波長(zhǎng)特征熒光的強(qiáng)度可推算體系單線態(tài)氧產(chǎn)量。設(shè)定不同pH 條件下的光照組和空白對(duì)照組，體系中加入過(guò)量的DCFH-DA探針。 不同pH 條件的光照組每隔30 s 光照一次， 并且在光照后立即檢測(cè)于酶標(biāo)儀中檢測(cè)熒光值?？瞻讓?duì)照組則只孵育DCFH-DA 探針，不加入ZnPc(TAP)4光敏劑。 連續(xù)檢測(cè)3 min 后，匯集數(shù)據(jù)，用軟件繪制不同pH 條件下ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)量曲線。

1.2.3 細(xì)胞的計(jì)數(shù)與觀察

取凍存于液氮中的人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞HELF，復(fù)蘇后分別傳代培養(yǎng)，約2～3 代后的細(xì)胞在顯微鏡不同倍數(shù)下觀察細(xì)胞狀態(tài)。 貼壁細(xì)胞應(yīng)鋪滿80%以上T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，可保證實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞數(shù)目。觀察細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化傳代。細(xì)胞傳代：使用一次性無(wú)菌吸管吸去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有的細(xì)胞培養(yǎng)液，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞表面1～2 次，加入1 mL 預(yù)熱的胰蛋白酶溶液，37℃培養(yǎng)箱中靜置約1 分鐘。用一次性無(wú)菌吸管吸去細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的胰蛋白酶溶液，加入10 mL 新鮮、37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)基，使用5 mL 移液槍吹打均勻細(xì)胞，盡可能將T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部細(xì)胞全部吹打下來(lái)。 吸取部分細(xì)胞培養(yǎng)液于離心管中用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，另取5 mL 新鮮、37℃溫浴的細(xì)胞培養(yǎng)液于T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，均勻后分別于37℃、CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對(duì)ZnPc(TAP)4 光敏劑的藥物攝取分析

按上述方法，在生物顯微鏡低倍鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，加入適量新鮮、37 ℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至所需細(xì)胞實(shí)驗(yàn)濃度（50 000 個(gè)/ mL），吹打均勻后將細(xì)胞均勻轉(zhuǎn)移至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL 細(xì)胞懸液至終濃度為10 000 個(gè)細(xì)胞/孔，將細(xì)胞置于37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)置人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞HELF 的攝取實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔以減小實(shí)驗(yàn)誤差。 給予細(xì)胞賦予相同的藥物濃度（2 μmol/L），在不同的時(shí)間點(diǎn)（0、6、12 和 24 h）檢測(cè)ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取量。 具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：到達(dá)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)后，將孔中培養(yǎng)基棄去，用無(wú)菌PBS 或無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌3 次，加入200 μL 裂解液（主要成分為0.1 M NaOH / l% SDS）裂解1 h，使體系形成均一溶液。 在酶標(biāo)儀中測(cè)定細(xì)胞提取液的熒光信號(hào)，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞的總蛋白量。 取實(shí)驗(yàn)孔裂解液 20 μL 至 96 孔透明板，加入 200 μL BCA 工作液，室溫靜置 2 h，檢測(cè) 562 nm處紫外/可見(jiàn)吸收值。 根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞的總蛋白量。 用每毫克蛋白含有多少毫克的ZnPc(TAP)4光敏劑來(lái)表示細(xì)胞對(duì)藥物的攝取。1.2.5 ZnPc(TAP)4光敏劑的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞毒性分析

按前述方法，用生物顯微鏡低倍鏡觀察乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和正常HELF 細(xì)胞狀態(tài)。 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，分別加入適量新鮮、37 ℃溫浴的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液至所需實(shí)驗(yàn)細(xì)胞濃度（50 000 個(gè)/mL），吹打混勻后于細(xì)胞 96 孔板鋪板細(xì)胞，每孔加入 200 μL 細(xì)胞懸液（10 000 個(gè)/孔），于 37 ℃、CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)過(guò)夜。 配置不同濃度的ZnPc(TAP)4光敏劑溶液備用。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，設(shè)置不同濃度的實(shí)驗(yàn)組（0.5， 1， 2， 4， 8 μmol/L）。 洗去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度 ZnPc(TAP)4光敏劑的培養(yǎng)基，藥物孵育2 h。 光敏劑孵育后，吸去細(xì)胞96 孔板培養(yǎng)孔內(nèi)原有的藥物培養(yǎng)液，加入200 μL 新鮮、37 ℃溫浴的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗1 次，再 加入200 μL 新鮮、37 ℃溫浴的細(xì)胞培養(yǎng)液。 混勻后，使用680 nm、100 mW 光源對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行均勻光照1 min（光劑量2.5 J/cm2）。光照后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置37 ℃、CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)過(guò)夜。 24 h 后，利用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。 MTT 全稱為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃顏色的染料，MTT 比色法可以檢測(cè)細(xì)胞存活率。 活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可以使外源性MTT 變成水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，通常已死亡的細(xì)胞不存在這種現(xiàn)象。 此后利用二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞甲瓚，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，計(jì)算出細(xì)胞的存活率、繪制細(xì)胞存活率曲線圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ZnPc(TAP)4光敏劑的pH靈敏性

酞菁類光敏劑在生物應(yīng)用過(guò)程中，藥物的自發(fā)聚集情況是不可忽視的一方面。 光敏劑聚集容易降低其單線態(tài)氧產(chǎn)量，降低了光動(dòng)力抗腫瘤的治療效果[7]。 ZnPc(TAP)4光敏劑帶有12 個(gè)二甲氨甲基基團(tuán)，pH 值的改變會(huì)影響其在水中的聚集程度。 配置不同pH 的緩沖液，研究ZnPc(TAP)4光敏劑的pH 靈敏性，分析ZnPc(TAP)4光敏劑的聚集情況有助于探索ZnPc(TAP)4光敏劑的活性。 結(jié)果如圖1 所示，ZnPc(TAP)4光敏劑的紫外吸收最大峰位置隨緩沖液pH 值升高發(fā)生了移動(dòng)，當(dāng)pH 值為8.0 時(shí)，Zn-Pc(TAP)4光敏劑的最大吸收峰位于650 nm 左右，光敏劑處于聚集狀態(tài)；當(dāng)pH 值降低至6.0 時(shí)，ZnPc(TAP)4光敏劑的最大吸收峰位轉(zhuǎn)移到690 nm 左右，光敏劑處于單體狀態(tài)。 證明ZnPc(TAP)4光敏劑具有靈敏的pH 響應(yīng)性能。 同時(shí)，ZnPc(TAP)4光敏劑的熒光圖譜隨緩沖液pH 值的改變也發(fā)生了明顯變化：當(dāng)pH 值為 8.0 時(shí)，ZnPc(TAP)4光敏劑的特征熒光值較小；當(dāng)pH 值降低至 6.0 時(shí)，ZnPc(TAP)4光敏劑的特征熒光值顯著升高，達(dá)到6 000 左右，是pH 8.0 狀態(tài)熒光值的30 倍。 此差異主要由于其的活性狀態(tài)不同：pH 值為 8.0 時(shí) ZnPc(TAP)4光敏劑處于聚集狀態(tài)，pH 值為 6.0 時(shí)，ZnPc(TAP)4光敏劑處于單體狀態(tài)。 進(jìn)一步證明ZnPc(TAP)4光敏劑能夠在1 個(gè)pH 單位內(nèi)快速轉(zhuǎn)變其活性，這一優(yōu)勢(shì)有利于提高藥物的生物利用度。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人體內(nèi)的正常生理環(huán)境或正常細(xì)胞的細(xì)胞外pH 約為7.4，而腫瘤細(xì)胞環(huán)境因其缺氧、產(chǎn)生大量的代謝物，導(dǎo)致周邊腫瘤微環(huán)境維持偏酸性[8]，因此，ZnPc(TAP)4光敏劑所具有的靈敏pH 響應(yīng)、單體和聚集體快速轉(zhuǎn)換性能，有利于在抗腫瘤治療中提高藥物的利用度。 酞菁類光敏劑的熒光強(qiáng)度還與藥物的光敏活性有關(guān)，高強(qiáng)度的熒光有利于藥物對(duì)腫瘤進(jìn)行光學(xué)成像，有助于腫瘤的診斷和治療[9-10]。

圖1 ZnPc(TAP)4 光敏劑的pH 靈敏性

2.2 ZnPc(TAP)4光敏劑在不同pH條件下的單線態(tài)氧產(chǎn)量

酞菁鋅光敏劑在特殊波長(zhǎng)光照條件下能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧，作用于周邊環(huán)境，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。 因此，檢測(cè)ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)量具有重要意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。ZnPc(TAP)4光敏劑在不同pH 條件下均有單線態(tài)氧產(chǎn)生，且其單線態(tài)氧產(chǎn)量與pH 值的大小存在明顯的負(fù)相關(guān)。 在pH 6.0 時(shí)，ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)量約是pH 8.0時(shí)的5 倍，證明ZnPc(TAP)4光敏劑在偏酸性環(huán)境中有更高的單線態(tài)氧產(chǎn)量。 結(jié)合ZnPc(TAP)4光敏劑的紫外和熒光特性，單線態(tài)氧產(chǎn)量的差異主要與其在不同pH 值條件下單體-聚集體轉(zhuǎn)換性能有關(guān)。 pH 6.0 時(shí)ZnPc(TAP)4光敏劑處于單體狀態(tài)，能夠產(chǎn)生更多的單線態(tài)氧，這有助于提高ZnPc(TAP)4光敏劑的腫瘤細(xì)胞毒性。

圖2 ZnPc(TAP)4 光敏劑在不同pH 條件下的單線態(tài)氧產(chǎn)量

2.3 腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對(duì)ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取分析

研究細(xì)胞對(duì)ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取量有助于分析藥物的細(xì)胞毒性能力。 尤其是腫瘤細(xì)胞，其攝取ZnPc(TAP)4光敏劑的能力與腫瘤細(xì)胞毒性密切相關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)研究人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞HELF 對(duì)ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取能力。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。 正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞對(duì)ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取能力和藥物孵育時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)性。 腫瘤細(xì)胞在前3 個(gè)小時(shí)快速ZnPc(TAP)4光敏劑，在12～24 h 區(qū)間仍然有顯著的藥物攝取。 相比于腫瘤細(xì)胞，正常細(xì)胞對(duì)ZnPc(TAP)4光敏劑的攝取要相對(duì)緩和，在前12 h 逐步攝取藥物，并且在12 h 后趨于穩(wěn)定， 達(dá)到攝取平臺(tái)期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證明相同的藥物濃度和孵育時(shí)間情況下， 腫瘤細(xì)胞對(duì)ZnPc(TAP)4的攝取能力明顯大于正常細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞對(duì)ZnPc(TAP)4光敏劑的攝取量約是正常細(xì)胞的2～3 倍。 這可能是由于腫瘤細(xì)胞表面通常帶負(fù)電荷，ZnPc (TAP)4光敏劑能夠更好地吸附于腫瘤細(xì)胞并且被腫瘤細(xì)胞攝取；同時(shí)，在腫瘤微酸性環(huán)境中，ZnPc(TAP)4光敏劑呈現(xiàn)單體狀態(tài)，具有更好的藥物活性。

圖3 腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對(duì)ZnPc(TAP)4 光敏劑的藥物攝取情況

2.4 ZnPc(TAP)4光敏劑的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞毒性

對(duì)于光動(dòng)力治療中使用的酞菁鋅光敏劑，最重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)就是藥物的細(xì)胞毒性[11-12]。 本文選取正常的成纖維細(xì)胞HELF 和乳腺癌細(xì)胞MCF-7 來(lái)研究ZnPc(TAP)4光敏劑的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞毒性。 成纖維細(xì)胞HELF 和乳腺癌MCF-7 細(xì)胞經(jīng)過(guò)復(fù)蘇活化至達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求， 將細(xì)胞接種于實(shí)驗(yàn)板上。設(shè)置不同的藥物濃度梯度 0.5，1，2，4，8 μmol/L，用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示，ZnPc(TAP)4光敏劑在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 具有明顯的腫瘤細(xì)胞毒性，在8 μmol/L 時(shí)就能夠使95%的腫瘤細(xì)胞死亡；相比于腫瘤細(xì)胞，ZnPc(TAP)4 光敏劑對(duì)成纖維細(xì)胞HELF 的細(xì)胞毒性顯著降低。 當(dāng)藥物濃度為2 μmol/L 時(shí)，ZnPc(TAP)4光敏劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性約是正常細(xì)胞的2～3 倍。這主要是由于腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物導(dǎo)致其處于微酸性環(huán)境， 而正常細(xì)胞的酸堿性相對(duì)平衡，處于偏中性的環(huán)境中。 ZnPc(TAP)4光敏劑在腫瘤細(xì)胞的微酸性環(huán)境中維持單體狀態(tài)，其最大紫外吸收峰位于690 nm 左右，能夠產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧，實(shí)現(xiàn)了高效的腫瘤細(xì)胞毒性。而在正常細(xì)胞環(huán)境中，大部分ZnPc(TAP)4光敏劑最大紫外吸收峰處于650 nm 的聚集體狀態(tài)，導(dǎo)致較少的單線態(tài)氧產(chǎn)量，降低了其對(duì)正常細(xì)胞的毒性。 因此，ZnPc(TAP)4光敏劑所具有的高靈敏pH響應(yīng)性能賦予其獨(dú)特的腫瘤細(xì)胞選擇毒性，具有高效“靶向”殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

圖4 ZnPc(TAP)4 光敏劑對(duì)細(xì)胞的毒性分析

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，ZnPc(TAP)4光敏劑具有靈敏的pH 響應(yīng)性能，具有高效“靶向”殺傷腫瘤細(xì)胞的能力和較低的正常細(xì)胞毒性。 證明ZnPc(TAP)4光敏劑能夠在1 個(gè)pH 單位內(nèi)快速轉(zhuǎn)變其活性，有利于提高藥物的生物利用度：藥物在生理?xiàng)l件（生理pH 約7.4）下具有較低的細(xì)胞毒性，保證藥物的穩(wěn)定性和體內(nèi)安全運(yùn)輸；當(dāng)藥物到達(dá)腫瘤微酸性環(huán)境時(shí)（腫瘤微環(huán)境pH 約 6.5），能夠從聚集態(tài)轉(zhuǎn)變成更有活性的單體狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)更好的腫瘤細(xì)胞毒性作用。 同時(shí)，ZnPc(TAP)4光敏劑在微酸性環(huán)境中，其熒光顯著增強(qiáng)，有助于對(duì)體內(nèi)腫瘤進(jìn)行光學(xué)成像和診斷。 目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的應(yīng)用于臨床診斷的光敏劑藥物包括四環(huán)素、金絲桃素、血卟啉衍生物(HpD)、5-氨基酮戊酸(ALA)及其酯類衍生物氨基酮戊酸己酯( HAL) 等。其中5-氨基酮戊酸( ALA)/PpIX 熒光成像利用激光光敏技術(shù)可以看到發(fā)射紅色熒光的增生組織，可輔助病變定界、識(shí)別殘留病灶、提高照光成功率和減少?gòu)?fù)發(fā)[13]。雖然如此，目前絕大多數(shù)的光敏藥物在臨床治療和診斷過(guò)程中仍然面臨較大挑戰(zhàn)，本課題研究的ZnPc(TAP)4光敏劑在腫瘤治療和熒光診斷方面具有鮮明特點(diǎn)，對(duì)于更好地推進(jìn)光敏劑的臨床應(yīng)用具有一定的參考價(jià)值和前景。