吳 波 謝 晶
(1. 上海海洋大學食品學院,上海 201306;2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306;3. 上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺,上海 201306;4. 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心〔上海海洋大學〕,上海 201306)
石斑魚為鱸形目鮨科斑魚屬,營養(yǎng)價值高,富含蛋白質(zhì),脂肪含量少,是優(yōu)質(zhì)的高端養(yǎng)殖海水魚類,鮮活石斑魚更是深受消費者青睞[1]。石斑魚養(yǎng)殖地區(qū)較多分布于中國海南、廣東等南部地區(qū)[2-5]。隨著消費者需求量增加,鮮活石斑魚市場流通率高,經(jīng)濟效益好,為實現(xiàn)鮮活石斑魚長時間遠距離運輸,研究其活運工藝十分必要。
溶解氧含量的高低會影響有水活運過程中鮮活水產(chǎn)品的呼吸速率、生理代謝,進而影響其生命活動,使鮮活水產(chǎn)品的抗氧化能力降低、防御系統(tǒng)失衡,進而引發(fā)氧化應(yīng)激[6-7]。氧化應(yīng)激是指機體受到應(yīng)激原刺激后,魚體內(nèi)產(chǎn)生大量活性自由基,引起機體生理和病理反應(yīng)[8]202-205。過度氧化應(yīng)激使魚體抗氧化系統(tǒng)中各類抗氧化酶無法及時清除多余自由基,機體加速代謝,產(chǎn)生大量脂質(zhì)產(chǎn)物破壞機體細胞及組織,引發(fā)氧化損傷,導致抗氧化系統(tǒng)紊亂失衡[9]7-9。熊向英等[10]、陳世喜等[11]、Lavaud等[12]均研究發(fā)現(xiàn),過低的溶解氧含量會使魚體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),短時間缺氧在溶解氧濃度恢復后,其肝損傷雖略有恢復但無法恢復至初期,長時間缺氧則會導致明顯的病理變化;王曉雯等[13]、況新宇等[14]、Camilla等[15]研究發(fā)現(xiàn)高溶氧對魚體的各類抗氧化酶活性影響不大,但一定程度上會影響魚體免疫功能;Li等[16]研究發(fā)現(xiàn),急性和慢性缺氧環(huán)境均會影響羅非魚機體代謝,對機體抗氧化功能有負面影響。
鮮活水產(chǎn)品有水活運過程中,公路引起的振動也是影響其機體應(yīng)激的環(huán)境因子之一。振動會引發(fā)魚體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),發(fā)生機械損傷。張飲江等[17]、張宇雷等[18]均研究了振動脅迫對魚體血清生化指標的影響,發(fā)現(xiàn)振動脅迫會使魚體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),影響活運魚體的存活率。
近年來,國內(nèi)外學者對溶氧量在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中應(yīng)用的研究頗多,但對鮮活水產(chǎn)品有水活運工藝影響中的研究較少,而該環(huán)境因子是有水活運工藝的重要參數(shù)之一;同時,對振動幅度作為外力不可控環(huán)境因子研究甚少。試驗擬就溶氧量和運輸裝備振動幅度對活魚抗氧化功能的影響進行研究,以期為活魚有水長途運輸工藝的優(yōu)化提供理論參考。
1.1.1 材料
石斑魚:珍珠龍膽石斑魚,購自上海市浦東新區(qū)蘆潮港,選取同一批體質(zhì)健康無傷病,平均體長為(27.50±1.55) cm,平均體重為(500±120) g,加水充氧運輸至實驗室。石斑魚購回后將其停食暫養(yǎng)于實驗室水族箱48 h,暫養(yǎng)密度2 kg/m3,水溫23~24 ℃,鹽度26‰,空氣泵充氧,充氧速率22 L/min,pH 7.0,暫養(yǎng)期間每日50%換水。
1.1.2 主要儀器設(shè)備
模擬運輸振動臺:LX-100VTR型,上海魯軒儀器設(shè)備廠;
全波長酶標儀:SH-1000Lab型,北京宏昌信科技有限公司;
水族箱三合一曝氣機:YL-9800型,甬靈天興氣泵廠;
多點溫度采集儀:F2640型,美國Fluke公司;
高速冷凍離心機:5810R型,上海艾測電子科技有限公司;
全自動循環(huán)水冷機:HL-380CA型,廣東海利集團;
便攜式溶解氧測定儀:JPB-607A型,上海儀電科學儀器股份有限公司。
1.2.1 試驗設(shè)計 魚體暫養(yǎng)后進行冷馴化,冷水機以3 ℃/h 降溫速率[19]將暫養(yǎng)箱中水溫從23~24 ℃降至石斑魚有水活運最佳溫度16 ℃[20]。冷馴化后,將魚體分別放入溶氧量為2.5,5.0,7.5 mg/L運輸箱中進行模擬運輸試驗。控制運輸水中的溶解氧含量方式為:
① 2.5 mg/L:運輸前運輸水停止曝氣,并向水中充入純CO2使運輸水處于極低溶解氧(2.5 mg/L)環(huán)境;
② 5.0 mg/L:運輸前運輸水停止曝氣一段時間待溶解氧含量低時,充入純氧使運輸水溶解氧含量達到5.0 mg/L;
③ 7.5 mg/L:在運輸過程中加入曝氣石,實現(xiàn)持續(xù)曝氣,使運輸過程中水溶解氧含量處于持續(xù)飽和狀態(tài)。
根據(jù)道路等級標準劃分為A級路面和B級路面[21],根據(jù)其顛簸程度不同,調(diào)整模擬運輸振動臺的振動頻率,A級路面:300 r/min即為40 km/h;B級路面:450 r/min即為60 km/h,模擬運輸24 h,運輸環(huán)境為水溫16~18 ℃,鹽度24‰~26‰,pH 7.5~8.5;該試驗共分為6組,每組樣品15條,試驗總數(shù)為100條;取樣時間點為:運輸0,3,10,17,24 h,每個時間點每個處理組隨機取樣3條魚進行指標測定。試驗組具體安排如表1所示。
1.2.2 樣品處理 石斑魚木棒敲擊致暈,稱重和量體長,1 mL一次性醫(yī)用注射器(預先用1%肝素鈉溶液潤洗)尾部靜脈取血法,采取血樣在4 ℃冰箱放置2 h后,進行4 ℃、6 000 r/min、10 min離心制備血清,血清分裝后移入-80 ℃保存?zhèn)溆茫蝗∑浔巢考∪饨M織和肝臟組織,用生理鹽水漂洗吸干水分,分裝后移入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 抗氧化指標測定 試驗測定指標為過氧化氫酶(CAT)活性、還原型谷胱甘肽(GSH)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、抗超氧陰離子活力(ARSO)、丙二醛(MDA)、糖原、乳酸(LD)均使用南京建成生物有限公司試劑盒進行測定;蛋白質(zhì)濃度的測定采用考馬斯亮藍法。
表1 不同溶解氧含量及振動幅度試驗組Table 1 Different dissolved oxygen content and vibration amplitude test groups
1.2.4 數(shù)據(jù)處理 以上指標每次測定設(shè)3次平行,取平均值并用Origin 8.5軟件繪圖,并使用IBM SPSS Statistics 24進行顯著性分析(P<0.05表明存在顯著差異)。
鮮活水產(chǎn)品在運輸過程中,機體通常會受到低氧、振動等外界刺激,發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氮自由基(RNS)和活性氧自由基(ROS),損傷機體細胞、組織,機體內(nèi)部失衡,此時,機體啟動自身抗氧化防御系統(tǒng)以應(yīng)對氧化應(yīng)激反應(yīng)[8] 206-210[9]7-10。機體抗氧化防御系統(tǒng)中含有大量抗氧化酶以清除體內(nèi)多余自由基,使機體恢復平衡,其中,超氧化物歧化酶(SOD)是最主要的酶類抗氧化劑,用于清除體內(nèi)多余的超氧陰離子,輔助其清除體內(nèi)多余自由基的抗氧化劑還有過氧化氫酶(CAT)以及還原型谷胱甘肽酶(GSH),三者協(xié)同作用,降低氧化應(yīng)激對鮮活水產(chǎn)品的影響,因此,本試驗將SOD、CAT、GSH 3種酶活性作為鮮活水產(chǎn)品氧化應(yīng)激的指示指標[22-25]。如圖1所示,3種抗氧化酶活性均隨運輸時間的延長呈先上升后下降的趨勢。各組SOD活性在運輸10 h均呈現(xiàn)上升趨勢,且A、D、F組上升幅度顯著大于B、C、E組(P<0.05),10 h后SOD活性開始下降,且A、D、F組下降幅度顯著大于B、C、E組(P<0.05),說明低氧環(huán)境下,鮮活石斑魚發(fā)生了強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng),導致體內(nèi)自由基數(shù)量激增,SOD作為機體抗氧化的第一道屏障,其活性迅速增加以快速清除過量自由基后活性開始下降;CAT、GSH作為體內(nèi)輔助抗氧化劑在石斑魚運輸17 h時均呈顯著上升趨勢(P<0.05),說明SOD不能完全清除過量自由基,CAT、GSH活性迅速增加進一步清除多余自由基,以維持機體抗氧化系統(tǒng)的平衡,防止機體細胞、組織等被進一步損傷。其中,A、D組各抗氧化酶活性增長速度均顯著高于其他組且活性最大,說明極低氧運輸水環(huán)境下石斑魚氧化應(yīng)激反應(yīng)劇烈,因而不推薦作為有水活運的溶解氧含量。陳世喜等[11]研究發(fā)現(xiàn)隨著低氧脅迫持續(xù)時間的延長,SOD、GSH呈先上升后下降趨勢,與本試驗研究結(jié)果一致。F組各抗氧化酶活性增加速率及最大活性值僅此于A、D組,說明該運輸條件下鮮活石斑魚體內(nèi)產(chǎn)生大量甚至過量自由基需清除,石斑魚氧化應(yīng)激反應(yīng)強烈,表明持續(xù)曝氣條件下,強振運輸條件會使鮮活石斑魚發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),在鮮活水產(chǎn)品有水活運過程中,惡劣的運輸條件不僅使機體產(chǎn)生機械損傷,同時會破壞機體抗氧化系統(tǒng),不利于運輸;B、C、E組機體各抗氧化酶活性隨運輸時間延長呈先上升后下降趨勢,但各酶活性整體變化并不顯著;B、E組機體GSH酶活性隨運輸時間的延長先上升后緩慢下降,輔助抗應(yīng)劑活性的增加說明機體因發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生過量自由基需及時清除,酶活性開始下降可能是因為自由基過量導致機體抗氧化系統(tǒng)不可逆損傷而無法進一步自行修復,也可能因為機體自身修復有效使機體抗氧化系統(tǒng)自由基含量維持穩(wěn)定,使系統(tǒng)保持平衡。在此研究中,酶活性恢復至初始狀態(tài)并逐步維持穩(wěn)定水平,說明機體抗氧化系統(tǒng)得以有效維持平衡,推論B、E組發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)不強烈;C組機體在持續(xù)曝氣供氧狀態(tài)下弱振運輸,各抗氧化酶活性變化均不顯著(P>0.05),機體可通過自行修復弱損傷維持機體抗氧化系統(tǒng)平衡,該工藝適合石斑魚有水活運。在模擬石斑魚有水活運過程中,通過評價SOD、CAT、GSH 3種酶活清除機體多余自由基消耗量及失活程度,發(fā)現(xiàn)飽和溶解氧水環(huán)境及平穩(wěn)運輸條件,可有效降低機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)程度,減少機體氧化損傷及機械損傷。
抗超氧陰離子活力(ASOR)、總抗氧化能力(T-AOC)是反映機體抗氧化能力的直觀指標,當機體受到外界應(yīng)激源刺激時,機體會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),肝臟組織中的ASOR活力會迅速提升以清除多余的超氧陰離子,維持抗氧化防御機體平衡;隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)時間的延長、強度變大,機體總抗氧化能力會隨之下降[26],見圖2。由圖2(a)可知,隨著石斑魚有水活運時間的延長,肝臟組織中ASOR活力呈先上升后下降趨勢,其中,A、D組在運輸10 h時顯著上升且活力顯著高于其他4組(P<0.05),與此同時,A、D組T-AOC能力隨著運輸時間的延長呈顯著下降趨勢且下降幅度大(P<0.05),說明該兩組鮮活石斑魚在極低氧運輸環(huán)境下因發(fā)生了強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生了過量的自由基需要清除,從而ASOR活力顯著提高,但因氧化應(yīng)激持續(xù)時間長,反應(yīng)劇烈,機體內(nèi)ASOR不足以清除多余超氧陰離子,機體總抗氧化能力不斷下降,使機體抗氧化防御系統(tǒng)失衡,損傷機體細胞及組織。熊向英等[10]研究發(fā)現(xiàn),低氧脅迫下肝臟組織中ASOR活力會隨脅迫時間延長呈先上升后下降趨勢,T-AOC 活力顯著低于對照組,與本試驗研究結(jié)果相似。F組機體內(nèi)肝臟組織ASOR活力在運輸10 h時顯著上升且幅度較大,同時,T-AOC能力顯著下降(P<0.05),該組鮮活石斑魚雖處于飽和溶解氧狀態(tài)下模擬運輸,但因其運輸公路為B級,極為顛簸極易誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng);B、C、E組鮮活石斑魚處于較低溶解氧狀態(tài)和持續(xù)曝氣供氧狀態(tài)下模擬運輸,肝臟組織ASOR活力呈先上升后緩慢下降趨勢,變化并不顯著,其中,B、E組T-AOC能力顯著下降,C組T-AOC能力下降,但與初始值相比變化并不顯著。在石斑魚有水活運模擬試驗中,通過評價ASOR清除超氧陰離子能力及其活力變化,T-AOC能力變化,間接觀察機體抗氧化系統(tǒng)自身平衡能力,發(fā)現(xiàn)水中溶解氧含量是否充足、運輸車振動幅度均會直接影響機體氧化應(yīng)激反應(yīng)程度;在?;钸\輸工藝研究中,應(yīng)保證鮮活水產(chǎn)品有足夠供氧,保證運輸路面平緩,防止低氧及振動誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷機體細胞及組織。
圖1 溶解氧濃度、振動幅度對有水活運過程中石斑魚組織中抗氧化酶活性的影響Figure 1 Effects of different dissolved oxygen concentrations and vibration amplitude on antioxidant enzyme activities in grouper tissues during water transport
圖2 不同溶解氧濃度、振動幅度對有水活運過程中石斑魚抗氧化能力的影響
Figure 2 Effects of different dissolved oxygen concentration and vibration amplitude on the antioxidant capacity of grouper in the process of water transport
鮮活水產(chǎn)品運輸過程中發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)后,機體內(nèi)會產(chǎn)生大量自由基,自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng),生成大量代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA),損傷機體細胞及組織;低氧環(huán)境同時限制了鮮活水產(chǎn)品有氧呼吸,加快厭氧代謝速率,代謝產(chǎn)物乳酸(LD)迅速積累,因此,MDA和LD作為代謝產(chǎn)物可指示氧化應(yīng)激反應(yīng)程度及機體損傷程度[27],見圖3。各組石斑魚代謝產(chǎn)物MDA、LD均隨運輸時間的延長呈上升趨勢,其中,A、D組變化顯著(P<0.05)且代謝產(chǎn)物含量整體遠高于其他3組,說明極低氧環(huán)境會使鮮活水產(chǎn)品發(fā)生劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生大量自由基誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),加速代謝,導致代謝產(chǎn)物迅速積累過量,對機體造成不可逆氧化損傷;乳酸含量激劇增加說明無氧代謝速率快,低氧環(huán)境脅迫嚴重,其損傷不可逆;B、C、F組鮮活石斑魚處于極低溶解氧狀態(tài)及持續(xù)曝氣狀態(tài)下模擬運輸,其代謝產(chǎn)物MDA、LD呈增長趨勢,但與初始狀態(tài)相比無顯著性差異,說明氧化應(yīng)激反應(yīng)并不劇烈,對機體氧化損傷較小。在模擬石斑魚有水活運試驗中,通過評價脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA、無氧代謝產(chǎn)物LD含量的變化,反向說明低氧環(huán)境、強振動運輸下的機體氧化應(yīng)激反應(yīng)劇烈,超過自身平衡抗氧化系統(tǒng)最低耐受力,誘發(fā)各組織、細胞不可逆氧化損傷,因此,石斑魚在有水活運過程中應(yīng)持續(xù)曝氣供氧,使運輸水中溶解氧含量盡可能達到飽和狀態(tài),并盡量避免運輸過程中的劇烈振動。
圖3 不同溶解氧濃度、振動幅度對有水活運過程中石斑魚代謝產(chǎn)物的影響
Figure 3 Effects of different dissolved oxygen concentration and vibration amplitude on the metabolites of grouper in the process of water transport
糖原為機體內(nèi)主要能源供給者,肝臟作為機體抗氧化防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵組織,其糖原含量變化對于氧化應(yīng)激反應(yīng)程度的指示尤為重要,肌肉組織中糖原分解作為抗氧化功能的輔助能源供給者,與肝糖原協(xié)同作用,當機體無氧代謝時,糖原迅速分解為葡萄糖為機體生命活動、代謝提供能量[28]。由圖4可知,各組肌糖原、肝糖原均隨運輸時間的延長呈下降趨勢,在A、D組即極低氧組中,肝糖原、肌糖原顯著下降(P<0.05),下降幅度之大,說明糖原在迅速分解消耗以供機體無氧代謝的需求,反映了機體氧化應(yīng)激反應(yīng)劇烈,當運輸至24 h時,糖原含量顯著低于初始狀態(tài)且顯著低于其他4組,說明氧化應(yīng)激反應(yīng)對機體造成了不可逆的氧化損傷;F組糖原含量顯著降低且最終含量顯著低于初始值,說明機體即使處于飽和溶解氧狀態(tài)下,但受到劇烈振動,亦會誘發(fā)氧化應(yīng)激,造成機械損傷的同時具有嚴重的氧化損傷;B、C、E組中糖原含量呈現(xiàn)不同程度下降,B、C組運輸前后糖原含量無顯著差異且C組最佳,說明溶解氧含量、振動幅度均會不同程度誘發(fā)機體氧化應(yīng)激反應(yīng),長時間處于低氧環(huán)境、過度振動狀態(tài)下機體氧化應(yīng)激反應(yīng)更劇烈,在研究鮮活水產(chǎn)品有水活運工藝過程時,應(yīng)給予充足的溶解氧以保證機體穩(wěn)定的生命活動,降低應(yīng)激反應(yīng)以及氧化損傷。
在石斑魚有水活運工藝研究過程中,鮮活石斑魚運輸至目的地后的存活率是評價其工藝的重要指標之一。表2顯示了不同運輸組,即不同運輸包裝充氧方式及運輸陸路條件下,鮮活石斑魚的存活率。A、D組均為極低氧運輸組,石斑魚有水活運24 h后開始死亡,直至運輸72 h全部死亡,綜合上述各抗氧化指標可以發(fā)現(xiàn),極低氧運輸環(huán)境下鮮活石斑魚體內(nèi)自由基數(shù)量急增,引發(fā)劇烈氧化應(yīng)激反應(yīng),各抗氧化酶活性上升以調(diào)控機體內(nèi)平衡,消耗機體內(nèi)大量能量,但三道抗氧化酶屏障均無法完全清除多余自由基,導致抗氧化能力下降,脂質(zhì)代謝產(chǎn)物增加,對機體造成不可逆損傷甚至死亡,說明極低氧運輸水不適合鮮活石斑魚長途運輸;B、F組為偏低溶解氧弱振組與高溶解氧強振組,石斑魚有水活運48 h后開始死亡,在運輸72 h后存活率低于80%,雖然飽和溶解氧可以滿足運輸中石斑魚生命活動需求,但強烈的振動會誘發(fā)機械損傷,導致魚體出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;C、E組為持續(xù)供氧弱振組及充純氧強振組,石斑魚有水活運72 h后存活率均高于80%,綜合各類抗氧化指標結(jié)果顯示,持續(xù)供氧組石斑魚體內(nèi)自由基數(shù)量增加,發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),機體通過自身體內(nèi)抗氧化酶活性增加調(diào)節(jié),從而維持體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)平衡,在調(diào)節(jié)過程中,機體消耗能量,抗氧化能力下降,但在運輸結(jié)束后,各項酶活及抗氧化能力均能恢復初始水平,說明持續(xù)供養(yǎng)組石斑魚可通過機體自身調(diào)節(jié)以應(yīng)對氧化應(yīng)激反應(yīng),減少機體損傷,保證存活率,說明石斑魚有水活運過程中應(yīng)持續(xù)曝氣供氧,使運輸水中溶解氧處于飽和狀態(tài),可使運輸中的鮮活石斑魚維持較高的存活率;充純氧組,純氧并不能完全溶解于水中,使運輸水中溶解氧含量僅維持在偏低溶解氧水平,該包裝方式伴以強振運輸組的存活率僅次于持續(xù)曝氣組,說明運輸水溶解氧含量偏低時,適當?shù)卣駝佑兄谶\輸中運輸水非自主曝氣,輔助運輸水溶解氧含量在維穩(wěn)的過程中得以小范圍增加,以供鮮活石斑魚生命活動的需求。
圖4 不同溶解氧濃度、振動幅度對有水活運過程中石斑魚糖原的影響
Figure 4 Effects of different dissolved oxygen concentration and vibration amplitude on glycogen of grouper during water transport
表2 不同運輸組與?;顣r間石斑魚的存活率Table 2 Survival rate of grouper at different groups and keeping alive time %
在石斑魚有水活運過程中,水中溶解氧含量、模擬運輸振動幅度均會誘發(fā)機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),影響機體抗氧化系統(tǒng),對機體造成嚴重的氧化損傷和機械損傷。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),極低氧組鮮活石斑魚可運輸時間短,運輸過程中各項抗氧化指標均發(fā)生顯著變化,且無法恢復至初始水平,各損傷不可逆;飽和溶解氧即持續(xù)曝氣組鮮活石斑魚可運輸時間長,存活率高,雖然各項抗氧化指標因應(yīng)激而發(fā)生變化,但最終恢復到了初始水平,并能通過自身抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激,保持體內(nèi)平衡;運輸前充氧組各項指標變化受振動幅度影響較大,弱振輔助曝氣,可使運輸包裝內(nèi)的溶解氧含量在維持穩(wěn)定的基礎(chǔ)上略有上升,維持一定的存活率。因此,石斑魚有水活運時建議運輸水應(yīng)持續(xù)曝氣,短途運輸可選擇運輸前充入純氧,在此基礎(chǔ)上,根據(jù)不同公路等級,規(guī)劃好運輸路徑,可在保證鮮活石斑魚存活率的同時有效降低運輸成本。試驗研究既定的6組溶解氧水平與運輸公路的運輸方式,在將來的研究中可增加試驗組,覆蓋更多的充氧方式及運輸公路水平,從而建立相關(guān)模型,為鮮活水產(chǎn)品運輸快速提供合適的溶解氧水平及運輸路線,高效便捷的前提下提高鮮活水產(chǎn)品存活率。