HPLC法同時測定刺玫果提取物中的黃酮類成分及其體外活性測定

邸 松 鐘方麗 張曉麗,2 王曉林 雷永平

(1. 吉林化工學(xué)院，吉林 吉林 132022；2. 吉林大學(xué)，吉林 長春 130012)

刺玫果為野生山刺玫的成熟果實，又名花傘薔薇，廣泛分布于東北、內(nèi)蒙等地[1]。其果實呈卵型或球型，香甜氣息濃郁，酸甜可食[2]。刺玫果含豐富的黃酮類、三萜類、皂苷、揮發(fā)油及氨基酸等成分，營養(yǎng)價值極高[3-4]。因其具有抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病作用，且抗氧化與治療高血脂效果顯著，近年來以刺玫果為主要原料的保健食品的開發(fā)受到了廣泛的重視[5]。

在刺玫果提取物黃酮類成分研究的報道中，采用HPLC法定性、定量黃酮類成分的研究較多，其中有同時測定蘆丁、金絲桃苷與槲皮素[6]，木犀草素與金絲桃苷[7]，槲皮素和山奈酚[8]的報道。但尚未見同時測定刺玫果提取物中金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素的報道。有關(guān)黃酮類成分體外活性的研究，大多都是總黃酮提取物、或經(jīng)過純化的總黃酮提取物進行體外活性研究。例如：通過測定DPPH自由基清除率[9]、ABTS自由基陽離子清除率[10]、羥基自由基清除率[11]以及抗脂質(zhì)過氧化作用[12]來評價其抗氧化活性；通過測定清除亞硝酸鹽活性、阻斷亞硝胺合成能力評價其抗癌活性[13]；通過測定抑制α-糖苷酶活性，評價供試品的降血糖活性[14]。這類試驗只表明了黃酮類成分協(xié)同作用的體外活性，未對其黃酮類單體成分及其單體復(fù)方配伍活性進行評價。同時也未有對刺玫果提取物中所含的黃酮類成分單體及單體復(fù)方配伍的活性研究。

試驗擬使用HPLC法，建立同時測定刺玫果提取物中4種黃酮類單體成分的方法，并分析對比各成分及單體對應(yīng)復(fù)方配伍的體外活性，以期為刺玫果提取物的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

刺玫果：安徽亳州醫(yī)藥材料總公司，由吉林化工學(xué)院藥學(xué)系薛健飛博士鑒定為成熟果實；

木犀草素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品：純度≥98.5%，成都曼思特生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：HPLC級，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

α-糖苷酶(酶活≥34 U/mg)、PNPG：生物試劑，上海生物科技有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Agilent-1260型，搭載DAD陣列檢測器，安捷倫科技有限公司；

紫外分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限公司；

酶標儀：PL-9602型，北京普朗新科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

(1) 供試品溶液的制備：參考楊揚等[15]對刺玫果總黃酮的提取純化工藝制備刺玫果提取物，采用乙醇熱回流法提取刺玫果總黃酮，使用D-101大孔樹脂對提取的刺玫果總黃酮進行純化，得到刺玫果提取物。精密稱取刺玫果提取物0.5 g，置于25 mL容量瓶中，加入60%乙醇水溶液15 mL，超聲處理30 min使其完全溶解后定容，過濾，取濾液5 mL置于10 mL容量瓶中定容，采用0.45 μm 濾膜過濾，即得供試品溶液。

(2) 對照品溶液的制備：精密稱取金絲桃苷對照品4.2 mg、蘆丁、木犀草素、槲皮素對照品各4.1 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，精密吸取上述各對照品溶液2.5 mL于25 mL容量瓶中并定容，得混合對照品溶液，放置在冰箱(4 ℃)內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 刺玫果提取物中4種黃酮類單體成分的含量測定

(1) 色譜條件及流動相考察：使用紫外分光光度計，在200～600 nm對蘆丁、金絲桃苷、槲皮素及木犀草素的甲醇溶液進行全波長掃描，對比掃描圖譜，選擇4種黃酮類單體成分均具有較大吸收的波長作為檢測波長。使用依利特ODS2C18色譜柱，柱溫35 ℃，進樣量20 μL。分別考察乙腈—0.1%磷酸水溶液、甲醇—0.1%磷酸水溶液、乙腈—甲醇—0.1%磷酸水溶液等度洗脫系統(tǒng)及梯度洗脫系統(tǒng)。根據(jù)理論塔板數(shù)、分離度、保留時間及峰型因素，從中優(yōu)選出流動相。

(2) 線性關(guān)系的考察：精密吸取混合對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于10 mL容量瓶中，定容，在色譜條件下進樣20 μL，測定峰面積，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。

(3) 方法學(xué)考察：① 精密吸取同一混合對照品溶液，在色譜條件下連續(xù)進樣6次，分別記錄4種黃酮類單體成分的峰面積，并計算RSD值。精密吸取供試品溶液20 μL，進樣6次，分別記錄4種黃酮類單體成分的峰面積，計算RSD值，考察儀器精密度。② 取同一批刺玫果提取物，按照供試品溶液制備方法進行溶液制備。按照色譜條件進樣6次，分別記錄4種黃酮類單體成分的峰面積，并計算RSD值。③ 吸取同一供試品溶液，分別在0，6，12，24，36，48 h進樣，分別記錄4種黃酮類單體成分峰面積，計算RSD值。

(4) 加樣回收率試驗及含量測定：稱取6份已知含量的刺玫果提取物，每份0.5 g，精密稱定。每份中分別加入金絲桃苷305 μg、蘆丁225 μg、槲皮素94 μg、木犀草素6 μg，按照供試品溶液制備方法進行制備。在1.2.2(1)所選擇的色譜條件下分別進樣20 μL，計算回收率。稱取0.5 g 刺玫果提取物，按供試品溶液配制方法配制供試品溶液，平行進樣3次，記錄4種黃酮類單體成分峰面積，將平均值代入線性關(guān)系計算刺玫果提取物中4種黃酮類單體成分含量。

1.2.3 體外活性測定 根據(jù)含量測定結(jié)果，配制4種黃酮單體成分的復(fù)方配伍，并對刺玫果提取物、4種黃酮單體及其復(fù)方配伍進行清除自由基、清除亞硝酸鹽、阻斷亞硝胺合成、抑制α-糖苷酶活性的測試。

(1) 清除DPPH自由基清除試驗：參照文獻[16]進行調(diào)整。吸取0.1 mg/mL DPPH自由基溶液17 mL于25 mL 容量瓶中，加入無水乙醇定容，制備DPPH自由基溶液。吸取2 mL不同質(zhì)量濃度的各種供試品溶液(VC溶液、刺玫果提取物溶液、4種黃酮類單體成分及復(fù)方配伍溶液)與DPPH自由基溶液，混合，混合液在室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm下測定吸光度A樣品，按式(1)計算自由基清除率，并計算IC50值。

(1)

式中：

RDPPH——DPPH自由基清除率，%；

Ak——2 mL無水乙醇與2 mL DPPH自由基溶液混合的吸光度；

Ad——2 mL供試品溶液與2 mL無水乙醇混合的吸光度。

(2) ABTS自由基陽離子清除試驗：參考文獻[17]配制ABTS自由基陽離子工作液。取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的各種供試品溶液與3.9 mL ABTS自由基陽離子工作液混合，23 ℃避光放置6 min，與734 nm測定吸光度，每份樣品平行操作2次，按式(2)計算自由基清除率，并計算IC50值。通過對比IC50，比較VC、刺玫果提取物、4種黃酮類單體成分及復(fù)方配伍體外抗氧化活性。

(2)

式中：

RABTS——ABTS自由基陽離子清除率，%；

Ak——0.1 mL水與3.9 mL ABTS自由基陽離子混合吸光度；

Ay——0.1 mL供試品與3.9 mL ABTS自由基陽離子混合吸光度。

(3) 抗脂質(zhì)過氧化試驗：以抑制率為指標，參照文獻[18]的試驗方法，對VC、刺玫果提取物、4種黃酮類成分單體及復(fù)方配伍的抗卵磷脂脂質(zhì)過氧化作用進行測試。在具塞試管中依次加入1 mL卵磷脂溶液，1 mL 0.4 mmol/L FeSO4溶液及1 mL供試品溶液混勻。于37 ℃ 避光水浴60 min，加入2 mL TCA-TBA-HCl混合液，90～100 ℃水浴15 min，迅速冷卻，以5 000 r/min離心10 min，取上清液在波長535 nm處測定吸光度As。空白管以1 mL重蒸水代替1 mL供試品溶液測得Ac，按式(3)計算抗脂質(zhì)過氧化抑制率。

(3)

式中：

RZ——抗脂質(zhì)過氧化抑制率，%。

(4) 清除亞硝酸鹽活性試驗：采用鹽酸萘乙二胺法[19]。在15 mL模擬胃液(pH=3.0)中加入2 mL供試品溶液混合，加入10 μg/mL的亞硝酸鈉溶液2.5 mL，37 ℃ 恒溫水浴反應(yīng)30 min，取出后立即加入0.4%對氨基苯磺酸溶液0.5 mL，混勻，靜置15 min后加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.25 mL及蒸餾水7 mL，混合均勻，放置15 min。于538 nm處測定吸光度，按式(4)計算自由基清除率，并計算IC50值。

(4)

式中：

RQ——亞硝酸鹽清除率，%；

Ai——加入供試品溶液的吸光度；

Aj——供試品溶液的吸光度；

A0——不加供試品溶液的對照組吸光度。

(5) 阻斷亞硝胺合成活性試驗：采用α-萘胺法[20]。取pH 3.0的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖溶液2.0 mL，加入2.0 mmol/L亞硝酸鈉溶液、2.0 mmol/L二甲胺溶液各0.6 mL、各供試品溶液1.0 mL，混合均勻，加入1.5 mL蒸餾水，37 ℃水浴恒溫反應(yīng)1 h，用移液管吸取1.0 mL溶液加到直徑7 cm的培養(yǎng)皿中，加入0.5%的碳酸鈉溶液0.5 mL，在254 nm紫外燈下照射15 min，取出后分別加入1%對氨基苯磺酸溶液1.5 mL、0.1%α-萘胺溶液0.5 mL、蒸餾水0.5 mL，搖勻，放置15 min后，用紫外分光光度計在525 nm處分別測定吸光度值，通過式(5)計算阻斷率。

(5)

式中：

RZD——亞硝胺合成阻斷率，%；

A0——未加提取液的比色管中亞硝酸鈉的吸光度；

Ax——加提取液的比色管中亞硝酸鈉的吸光度。

(6) 抑制α-糖苷酶活性試驗：根據(jù)賴小燕等[21]試驗方法進行調(diào)整。在96孔板中加入80 μL磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)、20 μL 2.5 mmol/L的PNPG底物溶液以及20 μL各供試品溶液，37 ℃水浴10 min。加入20 μL 1.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液反應(yīng)60 min，用100 μL 0.2 mol/L 碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，室溫放置15 min，用酶標儀在405 nm處測定樣品吸光度值，按式(6)計算抑制率，并計算IC50。

(6)

式中：

RM——α-糖苷酶活性抑制率，%；

Ak——20 μL磷酸鹽緩沖液代替20 μL供試品溶液的吸光度；

Ab——20 μL磷酸鹽緩沖液代替20 μLα-葡萄糖苷酶溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 刺玫果提取物中4種黃酮類單體成分含量的測定

2.1.1 色譜條件及流動相考察結(jié)果 根據(jù)紫外分光光度計全波長掃描結(jié)果，金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素在204，256，360 nm均具有較大吸收。其中204 nm及256 nm處干擾因素較多，故選擇360 nm作為檢測波長。對比4種黃酮類單體成分在不同流動相下的分離度、理論塔板數(shù)及峰型，結(jié)果表明：使用甲醇—0.1%磷酸水作為流動相，金絲桃苷和蘆丁相對應(yīng)的峰重疊，無法分離；乙腈—0.1%磷酸水作為流動相金絲桃苷和蘆丁的分離效果較差；最終確定采用乙腈(A)—甲醇(B)—0.1%磷酸水溶液(C)梯度洗脫，洗脫程序見表1。在色譜條件下分別進樣混合對照品溶液及供試品溶液，混合對照品溶液和供試品溶液譜圖見圖1。

2.1.2 線性關(guān)系 以混合對照品中4種黃酮類成分質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表2。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Flow phase gradient elution procedure

1. 金絲桃苷 2. 蘆丁 3. 槲皮素 4. 木犀草素

標準品擬合方程擬合度R2線性范圍/(μg·mL-1)金絲桃苷y=51.547x+25.3270.995 32.10～21.0蘆丁 y=43.086x+78.2280.995 32.05～20.5槲皮素 y=90.719x+33.2640.999 92.05～20.5木犀草素y=68.102x+34.5851.000 02.05～20.5

表2顯示，金絲桃苷在2.10～21.0 μg/mL，蘆丁、槲皮素及木犀草素在2.05～20.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 方法學(xué)考察 儀器精密度，方法重復(fù)性及供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性的RSD值均在3%以內(nèi)，表明儀器精密度，方法重復(fù)性以及供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，試驗結(jié)果見表3。

表3 方法學(xué)考察試驗數(shù)據(jù)Table 3 Methodological experimental data (n=6) %

2.1.4 加樣回收率及含量測定 4種黃酮類單體成分金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素的平均加樣回收率分別為98.02%，98.45%，99.15%，98.46%，RSD值分別為0.80%，1.92%，2.12%，2.89%。具體試驗結(jié)果見表4。含量測定結(jié)果顯示刺玫果提取物中金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素的含量分別為607.98，450.63，187.32，12.68 μg/g，結(jié)果見表5。

2.2 體外活性測試

2.2.1 DPPH自由基清除試驗 從圖2可以看出，刺玫果提取物、4種黃酮類成分及復(fù)方配伍(金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素按質(zhì)量比為47.9∶35.5∶14.8∶1.0進行混合得到4種黃酮類成分單體復(fù)方配伍)均具有一定的清除DPPH自由基活性。其中刺玫果提取物、蘆丁、木犀草素及復(fù)方配伍的活性弱于VC，槲皮素及金絲桃苷活性強于VC。刺玫果提取物清除DPPH自由基的活性較陽性對照Vc雖然較弱，但是IC50較為接近，與孟永梅等對刺玫果提取液清除DPPH自由基活性的研究結(jié)果相當[22]，但弱于黃刺玫乙酸乙酯層萃取物[23]。

2.2.2 ABTS自由基陽離子清除試驗 從圖3可以看出，各樣品均具有較強的清除ABTS+.的活性。其中槲皮素的清除能力最強，IC50值為29.5 μg/mL；復(fù)方配伍的清除能力最弱，對應(yīng)IC50值為196.2 μg/mL。槲皮素為五羥黃酮，其2、3位有雙鍵，3、7位有兩個羥基，可通過單電子轉(zhuǎn)移直接清除自由基[24]，所以具有極強的抗氧化活性。但由于刺玫果提取物中所含有的槲皮素較少，所以刺玫果提取物的抗氧化能力弱于槲皮素。

2.2.3 抗脂質(zhì)過氧化試驗 從圖4可以看出，槲皮素具有較強的抗脂質(zhì)過氧化作用，其活性強于VC，其IC50值為0.058 2 mg/mL。其他成分抗脂質(zhì)過氧化作用由強到弱的順序為金絲桃苷、木犀草素、刺玫果提取物、蘆丁及復(fù)方配伍。復(fù)方配伍組活性相較于刺玫果提取物明顯降低，說明刺玫果提取物中應(yīng)該含有其他具有較高體外活性的成分，由于天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中的酚羥基易被氧化成醌，從而具有較高體外抗氧化的活性，綜合分析認為刺玫果提取物中應(yīng)該含有一定量的多酚類成分。

表4 加樣回收率結(jié)果Table 4 Result of recovery tests

表5 樣品測定結(jié)果Table 5 Results of samples determination

2.2.4 清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成活性試驗 在體外模擬胃液條件下，分別考察了刺玫果提取物、4種黃酮類單體及復(fù)方配伍的清除亞硝酸鹽活性和阻斷亞硝胺合成活性，試驗結(jié)果分別見表6、7。

從試驗結(jié)果可以看出，刺玫果提取物、4種黃酮類成分單體及復(fù)方配伍，均具有一定的清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成活性。其中木犀草素清除亞硝酸鹽的活性最強，強于VC的清除活性；復(fù)方配伍阻斷亞硝胺合成活性為樣品中最好的，但弱于VC。刺玫果提取物能有效阻斷亞硝胺合成，其活性略低于復(fù)方配伍，而復(fù)方配伍的活性強于各單體本身，說明配伍后可能存在協(xié)同增效作用。

2.2.5α-糖苷酶抑制活性試驗 從表5中可以看出，刺玫果提取物、槲皮素及木犀草素的抑制活性優(yōu)于阿卡波糖，且槲皮素的抑制活性最強；蘆丁、金絲桃苷及復(fù)方配伍活性低于阿卡波糖，但也具有一定的抑制活性。雖然刺玫果提取物具有較強的體外降血糖活性，且活性強于桑葉總黃酮[25]。槲皮素對α-糖苷酶抑制活性，但刺玫果提取物中槲皮素的含量較低，所以刺玫果提取物中的降糖活性成分及機理還有待進一步研究。

圖2 樣品對DPPH·清除能力半抑制濃度比較

Figure 2IC50comparisons among clearance rate of DPPH· for the tested sample

圖3 樣品對ABTS+·清除能力半抑濃度比較

Figure 3IC50comparisons among clearance rate of ABTS+· for the tested sample

圖4 各成分抗脂質(zhì)過氧化作用半抑制濃度比較

Figure 4IC50comparisons among clearance rate of anti-liposome peroxidation effect for the tested sample

表6 清除亞硝酸鹽試驗結(jié)果Table 6 Results of sodium nitrite removal test

表7 阻斷亞硝胺試驗結(jié)果Table 7 Test results of blocking nitrosamine

表8 抑制α-葡萄糖苷酶試驗結(jié)果Table 8 Results of inhibiting enzyme activity of α-glucosidase

3 結(jié)論

研究建立了HPLC同時測定刺玫果提取物中4種黃酮類成分單體含量的方法，采用該方法測定的刺玫果提取物中金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素的含量分別為607.98，450.63，187.32，12.68 μg/g，研究結(jié)果表明建立的高效液相色譜含量測定方法具有良好的精密度，線性關(guān)系良好，結(jié)果準確可靠，可用于刺玫果提取物中黃酮類成分的含量測定。

大量研究[26-27]證實刺玫果提取物具有較好的體外活性，但均未對提取物與其中的黃酮單體及單體復(fù)方配伍的體外活性進行對比研究。體外試驗結(jié)果表明刺玫果提取物具有較好的體外抗氧化和降糖活性，在天然抗氧劑、降血糖以及保健食品的開發(fā)與應(yīng)用方面具有廣闊的發(fā)展前景。刺玫果提取物能有效地清除亞硝酸鹽，具有較好的阻斷亞硝酸鹽合成活性，可有效預(yù)防致癌、致畸及智力遲鈍的發(fā)生[28]。刺玫果提取物有中含有較多的活性成分，試驗只對其中的4種黃酮類化合物進行了定量分析，尚未對其做進一步的化學(xué)成分分離，其主要活性成分有待于進一步研究。