超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定炒貨中紐甜含量的不確定度評定

黃 坤 王會霞 范小龍 郭 嘉

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075；3. 綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430205)

紐甜屬于新型的強力功能性甜味劑，甜度約為蔗糖的12 000倍，其能量低、甜味柔和、無明顯異味，且高溫條件下穩(wěn)定性能十分優(yōu)異，因此被廣泛應(yīng)用于各類食品的生產(chǎn)過程中[1-4]，以改善口感和風味。測量不確定度是指根據(jù)所用到的信息表征賦予被測量值分散性的非負參數(shù)，是與測量結(jié)果緊密相關(guān)的參數(shù)，因此完整的測量結(jié)果應(yīng)同時包含被測量值及其測量不確定度[5]。目前食品中紐甜含量的測定大多采用高效液相色譜法，關(guān)于其不確定度的評定較少[6-8]，而采用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定結(jié)果的不確定度評定更少。為評估此方法的不確定度，研究擬參考相關(guān)文獻[9-11]，以已添加紐甜的市售葵花籽陽性樣品為例，對炒貨中紐甜的測定不確定度進行分析評定，確定有關(guān)不確定度分量的貢獻，在實際檢測過程中可對重點過程進行控制，以此保證測定結(jié)果的準確度和可信度，同時為其他甜味劑測定結(jié)果的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紐甜：≥98.0%，有效期至2020年4月，德國DR公司；

炒貨：實驗室抽檢樣品，包括市售瓜子、堅果和果仁等。

乙酸鋅、亞鐵氰化鉀：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

乙腈、甲醇、甲酸：色譜純，德國Merck公司；

超純水：電導(dǎo)率≤0.055 μS/cm，25 ℃，自制；

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：TQS型，美國Waters公司；

電子天平：ME2002E和XS204型，梅物勒-托利多儀器(上海)有限公司；

翻轉(zhuǎn)混勻器：Trayster型，德國IKA公司；

超聲波清洗儀：P300H型，德國Elma公司；

高速離心機：Allegra X型，美國Beckman Coulter公司；

全自動固相萃取系統(tǒng)：Preval SPE 6S型，北京普立泰科儀器有限公司；

C18固相萃取柱：Sep-pak型(6 mL、500 mg)，美國Waters公司；

氮吹儀：N-EVAPTM112型，美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 稱取樣品10 g左右置于50 mL離心管中，加入約30 mL水，翻轉(zhuǎn)混合0.5 min，于50 ℃水浴條件超聲處理10 min，冷卻后加乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各2 mL，混勻，于4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后過濾待用。準確移取10 mL濾液通過固相萃取柱，待液面降至柱床時，用5 mL水淋洗，棄去流出液，再用6 mL甲醇分兩次洗脫并收集凈化液至離心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，準確移取2 mL初始比例流動相渦旋復(fù)溶0.5 min，過0.22 μm 微孔濾膜，續(xù)濾液視實際情況稀釋一定倍數(shù)后供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.3.2 液相色譜條件 C18色譜柱：50 mm×2.1 mm，1.7 μm；流動相：0.1%的甲酸水—乙腈，流速0.3 mL/min；梯度分析程序：0～0.3 min，乙腈5%；0.3～0.8 min，乙腈5%升至65%；0.8～3.2 min，乙腈65%升至95%；3.2～3.3 min，乙腈95%；3.3～3.4 min，乙腈95%降至5%；3.4～5.0 min，乙腈5%；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

1.3.3 質(zhì)譜參數(shù) 選擇ESI離子源負離子模式，電噴霧電壓2.50 kV，脫溶劑氣流量700 L/h，錐孔氣流量50 L/h，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃。多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)采集參數(shù)見表1。

表1 紐甜的質(zhì)譜采集參數(shù)?Table 1 Acquisition parameters ofneotame for UPLC-MS/MS

? *定量離子。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立 樣品中紐甜的含量按式(1)計算。

(1)

式中：

X——樣品中紐甜的含量，mg/kg；

C——樣品溶液的濃度，ng/mL；

V——樣品定容體積，mL；

m——樣品的稱樣質(zhì)量，g；

2 不確定度的評定與合成

2.1 不確定度來源分析

從式(1)結(jié)合實際測定過程可知，紐甜測定結(jié)果不確定度urel(X)的主要來源包括：① 樣品溶液濃度引入的不確定度urel(C)；② 樣品溶液定容及稀釋引入的不確定度urel(V)；③ 樣品稱樣過程引入的不確定度urel(m)；④ 測量重復(fù)性引入的不確定度urel(x)；⑤ 回收率引入的不確定度urel(R)。

2.2 不確定度評定

2.2.1 樣品稱樣過程引入的相對標準不確定度urel(m)

其不確定度主要來源于重復(fù)性和天平的校準。

試驗中樣品的平均稱樣量為10.012 5 g，因此由樣品稱量引入的相對標準不確定度為：

2.2.2 樣品溶液濃度引入的相對標準不確定度urel(C)

其不確定度主要來源于標準溶液配制和標準曲線擬合。前者包括儲備液的配制、儲備液的稀釋和標準系列溶液制備3個過程。

(1) 標準儲備溶液的配制引入的相對標準不確定度urel(C1)：準確稱取11.5 mg紐甜標準品(≥98.0%)，用超純水超聲溶解并定容至100 mL，即得濃度為112.7 μg/mL的紐甜標準儲備溶液。

因此，由標準儲備溶液配制引入的相對標準不確定度為：

(2) 標準儲備溶液的稀釋引入的相對標準不確定度urel(C2)：用1 mL單標線吸量管(A級)吸取標準儲備溶液1 mL于100 mL單標線容量瓶(A級)中，用超純水定容至刻度，混勻，即得濃度為1.127 μg/mL中間儲備液；用1 mL吸量管吸取中間儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，即得濃度為112.7 ng/mL的標準使用溶液。采用矩形分布，各量具及溫度影響引入的不確定度見表2。

表2 標準儲備溶液稀釋引入的不確定度Table 2 Uncertainty from the dilution of stock solution

故溶液稀釋引入的相對標準不確定度為：

(3) 標準系列溶液配制過程引入的相對標準不確定度urel(C3)：用1 mL分度吸量管(A級)分別吸取標準使用溶液(112.700 ng/mL) 0.5，1.0 mL于10 mL單標線容量瓶(A級)中，用超純水定容至刻度，搖勻，分別得到5.635，11.270 ng/mL的標準工作溶液；用2 mL單標線吸量管(A級)吸取標準使用溶液2 mL于10 mL單標線容量瓶(A級)中，用超純水定容至刻度，搖勻，即得22.540 ng/mL 的標準工作溶液；用5 mL分度吸量管(A級)分別吸取標準使用溶液3，5 mL于10 mL單標線容量瓶(A級)中，用超純水定容至刻度，搖勻，分別得到33.810，56.350 ng/mL的標準工作溶液；用10 mL分度吸量管(A級)吸取標準使用溶液8 mL于10 mL單標線容量瓶(A級)中，用超純水定容至刻度，搖勻，即得90.160 ng/mL 的標準工作溶液；直接將標準使用溶液作為112.700 ng/mL的工作溶液。

故由系列溶液配制引入的相對標準不確定度為：

(4) 曲線擬合帶來的相對標準不確定度urel(C4)：分別取以上7種不同濃度的標準工作溶液各進樣1次，以系列標準溶液的濃度C對色譜峰面積作曲線，采用線性最小二乘法擬合得到回歸方程Y=A1C+A2(A1為斜率，A2為截距)，測定數(shù)據(jù)及計算結(jié)果如表4所示。由2.2.1、2.2.3和2.2.4可知測定液平均濃度C0為72.189 ng/mL，則由標準曲線擬合所產(chǎn)生的標準不確定度為：

(2)

表3 標準系列溶液制備引入的不確定度Table 3 Uncertainty from the preparation of series standard solutions

表4 標準曲線結(jié)果Table 4 Results of standard curve

式中：

A1——標準曲線的斜率，1 791.4；

A2——標準曲線的截距，-175.1；

p——對C0的測定次數(shù)，p=6；

n——標準工作溶液的測試次數(shù)，n=7；

綜上所述，由樣品溶液濃度引入的相對標準不確定度為：

urel(C)=

2.2.3 樣品溶液定容及稀釋引入的相對標準不確定度urel(V) 因2.2.4中測量重復(fù)性引入的標準不確定度已包含樣品溶液的定容及稀釋過程，故不再另行評定。

2.2.4 測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度urel(x)

取同一樣品，按1.3.1方法，1.3.2和1.3.3條件對其中紐甜的含量進行6次平行測定(n=6)，結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 5 Results of repeatability test

2.3 合成相對標準不確定度

樣品稱樣量、樣品溶液的濃度、測量重復(fù)性和回收率等分量彼此之間相互獨立，將各不確定度分量合成，即得紐甜測定結(jié)果的合成相對標準不確定度:

0.045 90。

各相對標準不確定度分量的貢獻值見圖1。

圖1 各相對標準不確定度分量的貢獻Figure 1 Contributions of relative standard uncertainty components

2.4 擴展不確定度

3 測量結(jié)果及其不確定度報告

用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定炒貨中紐甜的含量，測定結(jié)果為X=(7.69±0.71) mg/kg,k=2。

4 結(jié)論

研究采用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定炒貨中紐甜的含量，結(jié)果符合相關(guān)國標規(guī)定的誤差要求，不確定度評定過程合理有效。通過分析可知，影響紐甜的測定結(jié)果不確定度的因素主要為樣品溶液濃度和測量重復(fù)性，其次為測量回收率和樣品稱樣量；進一步分析可知樣品溶液濃度因素中貢獻較大的分量為標準儲備溶液的配制和標準曲線的制備。因此在實際檢測過程中要尤其關(guān)注標準溶液的相關(guān)操作過程和樣品重復(fù)性測定等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過增加標準物質(zhì)的稱樣量、使用準確度更高的量器、增加平行樣品的測定次數(shù)、盡量提高測量回收率等措施，同時確保人員操作的規(guī)范性和一致性，以此減小測量不確定度，從而保證檢測結(jié)果的準確性和可靠性。