安石榴苷對金黃色葡萄球菌毒力因子表達(dá)的抑制作用

徐云鳳 吳 倩 樊秋霞 王 新 夏效東

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3. 綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 綿陽 621000)

金黃色葡萄球菌是一類革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在自然界中廣泛存在，對生長環(huán)境要求低、環(huán)境耐受性強(qiáng)[1]，可污染從農(nóng)田到餐桌的任何一個環(huán)節(jié)，給人類健康帶來嚴(yán)重的安全隱患。據(jù)報道[2]，2011～2016年，在中國由金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的食源性疾病爆發(fā)案例314起，患病人數(shù)5 196人，死亡1人，僅次于副溶血性弧菌和沙門氏菌，位居第3位。在美國，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、彎曲桿菌被認(rèn)為是污染新鮮農(nóng)產(chǎn)品的最重要的食源性致病菌[3]。金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生多種毒力因子，例如溶血素、腸毒素、血漿凝固酶、毒性休克綜合征毒素等[4-5]。這些毒力因子主要為外毒素和侵襲性酶，或作為胞外蛋白分泌到環(huán)境中(包括食品基質(zhì))，或作為菌體表面蛋白在細(xì)菌侵染宿主的過程中發(fā)揮作用[6]。金黃色葡萄球菌致病性的強(qiáng)弱在很大程度上取決于其產(chǎn)生的毒力因子[7]，因此研究如何抑制和降低其毒力因子的表達(dá)是一個重要的課題。

近年來，由于抗生素的濫用，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌出現(xiàn)了不同程度的耐藥性，此外，消費者對合成防腐劑的安全性也存在質(zhì)疑，很多研究者[8]把目光轉(zhuǎn)移到天然產(chǎn)物，尤其是植物源天然活性物質(zhì)上。許多植物化合物，如多酚類、萜類以及生物堿等，在體外研究中均被發(fā)現(xiàn)具有一定的抑制微生物生長或毒力因子表達(dá)的作用[9-10]。因而從植物中探索安全有效的天然產(chǎn)物用于預(yù)防和控制食源性致病菌(如金黃色葡萄球菌)具有十分重要的意義。

安石榴苷是石榴皮中重要的生物活性物質(zhì)。據(jù)報道，安石榴苷具有抑菌[11]、抗病毒[12]、抗氧化[13]、抗炎癥[14]、抗癌[15]等多種生物活性作用。前期研究[16]表明，安石榴苷對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出良好的抑菌效果，最小抑菌濃度(MIC)為0.25 mg/mL，然而安石榴苷對金黃色葡萄球菌毒力因子的表達(dá)影響尚不清楚。試驗擬對安石榴苷處理后的金黃色葡萄球菌的溶血活性、凝固酶活性和產(chǎn)腸毒素情況進(jìn)行測定，并采用反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR技術(shù)檢測相關(guān)毒力基因的表達(dá)情況，以期為金黃色葡萄球菌的控制和安石榴苷的開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

安石榴苷：純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；

金黃色葡萄球菌：ATCC 29213，美國模式培養(yǎng)物集存庫，保存于-80 ℃冰箱；

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基、新鮮無菌脫纖維羊血、凍干兔血漿：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；

無菌濾膜：0.22 μm孔徑，美國Millipore公司；

總腸毒素檢測試劑盒：德國R-Biopharm公司；

引物：上海捷瑞生物工程有限公司；

石英砂(二氧化硅)：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

溶菌酶：20 000 U/mg，美國Amresco公司；

溶葡萄球菌素、瓊脂糖：美國Sigma公司；

EasyTaq?DNA 聚合酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；

細(xì)菌總RNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR試劑盒：寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：DPX-9082 B-2型，上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；

超凈工作臺：YT-CJ-IND型，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；

冷凍離心機(jī)：5804R型，德國Eppendorf公司；

PCR儀：9600型，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；

電泳儀：1645050型，美國Bio-Rad公司；

實時熒光定量PCR儀：iQ5型，美國Bio-Rad公司；

臺式恒溫振蕩器：TH2-312型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

酶標(biāo)儀：680型，美國Bio-Rad公司；

超微量核酸分析儀：Nano-200型，杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備 從冰箱取出金黃色葡萄球菌，于胰蛋白胨大豆瓊脂平板上活化培養(yǎng)。挑取單菌落于裝有腦心浸液培養(yǎng)基的試管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。然后用新鮮無菌的腦心浸液培養(yǎng)基將菌懸液的吸光度調(diào)至OD600 nm=0.5(含菌量約為108CFU/mL)。

1.2.2 菌落計數(shù) 采用梯度稀釋法將安石榴苷母液在無菌的10 mL離心管中進(jìn)行稀釋，使其濃度分別為0，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，2 MIC。加入等體積2倍濃度的腦心浸液培養(yǎng)基，使安石榴苷最終濃度為0，1/16 MIC，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，此時培養(yǎng)基的濃度變?yōu)?倍正常濃度。將上述菌懸液按照1%(體積分?jǐn)?shù))的接菌量接入到培養(yǎng)液中，混合均勻，37 ℃，130 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行系列10倍稀釋，涂板計數(shù)。

1.2.3 溶血活性的測定 參照Worlitzsch等[17]的方法測定溶血活性，修改如下：將上述菌懸液按1%的接菌量接入到含有安石榴苷的腦心浸液培養(yǎng)基中，使安石榴苷的終濃度分別為0，1/16 MIC，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，37 ℃，130 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)24 h，12 000 r/min 離心5 min，將上清液用0.22 μm孔徑的無菌濾膜過濾。取475 μL過濾后的樣品上清液于1.5 mL離心管中，加入25 μL 無菌脫纖維羊血，輕搖混勻，37 ℃孵育2 h。3 000 r/min 離心1 min，吸取200 μL上清液，轉(zhuǎn)移到96孔板中，450 nm下測定其吸光值。以不含安石榴苷的菌懸液上清作為陽性對照，以無菌腦心浸液培養(yǎng)基經(jīng)過同樣處理后作為空白對照。

1.2.4 凝固酶效價的測定 吸取0.5 mL無菌生理鹽水加入到凍干血漿西林瓶中，搖勻使之充分溶解，再加入上述不同濃度安石榴苷處理的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液0.3 mL，混合均勻后于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置。在6 h以內(nèi)，每間隔1 h觀察1次結(jié)果，若出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，即認(rèn)為待測菌液的血漿凝固酶為陽性，否則為陰性[18]。

1.2.5 總腸毒素的檢測 采用三明治(夾心)酶聯(lián)免疫反應(yīng)法[19]檢測安石榴苷對金黃色葡萄球菌總腸毒素表達(dá)量的影響。樣品處理方式同1.2.3，取無菌濾液稀釋5倍后進(jìn)行檢測。將酶聯(lián)免疫試劑盒中所有試劑溫度恢復(fù)至室溫，然后于室溫下按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

將所需數(shù)量的微孔條插入到框架中，向每個微量滴定孔中加100 μL樣品或陽性對照，輕搖混勻，包上封口膜，37 ℃孵育1 h；將液體全部倒掉，在吸水紙上輕輕拍打至傾倒完全，加入300 μL洗滌緩沖液，重復(fù)操作5次；加入100 μL酶連接物1溶液，用手輕輕搖動使其混勻，封口，37 ℃再孵育1 h；重復(fù)洗滌步驟；加入100 μL酶連接物2溶液，輕搖混勻，封口，37 ℃孵育30 min；再次重復(fù)洗滌步驟；加入100 μL底物/發(fā)色劑，輕搖混勻，封口，在37 ℃ 下避光孵育15 min；加入100 μL反應(yīng)終止液，在30 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測量每個孔的吸光值。

1.2.6 qRT-PCR法檢測毒力基因的表達(dá)

(1) 引物序列及特異性檢測：引物序列參照Qiu等[20]所使用的序列。取1 mL在腦心浸液培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液，離心(12 000 r/min,2 min)，棄上清液，加入1 mL無菌水后于干浴器中100 ℃ 加熱煮沸20 min；4 ℃，12 000 r/min 條件下離心5 min，并取上清液作為PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系如表1所示，反應(yīng)條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、1 min，35個循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃、10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在1 g/100 mL 的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，緩沖溶液為0.5 ×TBE。EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察在目標(biāo)位置有無條帶出現(xiàn)，且有無雜帶。

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system μL

(2) RNA的提取：按天根細(xì)菌/細(xì)胞RNA提取試劑盒說明進(jìn)行細(xì)菌RNA的提取，由于金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁比較厚，破碎困難，在操作中加入溶葡萄球菌素處理和石英砂震蕩破碎的步驟。

按上述方法進(jìn)行給藥處理，24 h后，取1 mL菌懸液于1.5 mL無RNA酶離心管中(離心管預(yù)先裝有20～30 mg 石英砂，并高壓滅菌處理)，12 000 r/min，4 ℃條件下離心2 min，棄上清，用無菌水洗滌1次；用含3 mg/mL溶菌酶的100 μL TE緩沖液重懸菌體，室溫孵育15 min；加入10 μg/mL溶葡萄球菌素3 μL，繼續(xù)孵育5 min；加入350 μL裂解液，渦旋振蕩1 min，冰浴2 min，重復(fù)5次，12 000 r/min離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；加入250 μL無水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱中，余下操作按試劑盒說明書進(jìn)行，最終得到RNA溶液。用微量核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，將RNA的濃度調(diào)為一致。

(3) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

(4) RT-PCR：按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，1個循環(huán)；95 ℃、5 s， 55 ℃、30 s，72 ℃、 30 s，40個循環(huán)(熒光定量)；95 ℃、15 s，1個循環(huán)；60～90 ℃、30 s，71個循環(huán)(溶解曲線)。

毒力相關(guān)基因相對定量結(jié)果以16S rRNA作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法表示。ΔΔCt按式(1)計算。

ΔΔCt=(Ct4-Ct3)-(Ct2-Ct1)，

(1)

式中：

ΔΔCt——處理組和對照組之間校正過的循環(huán)數(shù)變化；

Ct4——安石榴苷處理組目的基因的平均Ct值；

Ct3——安石榴苷處理組內(nèi)參基因的平均Ct值；

隨著多媒體技術(shù)的發(fā)展，“互聯(lián)網(wǎng)+”時代的來臨引發(fā)了外語教學(xué)的教學(xué)理念、教學(xué)過程、教學(xué)活動、教學(xué)方法和教學(xué)策略乃至教學(xué)目標(biāo)和教學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)等諸多教學(xué)模式要素的改變。在這樣的背景下，語言教學(xué)應(yīng)利用一切符號手段促進(jìn)教學(xué)，激發(fā)學(xué)生興趣，讓交際不再是利用一種感官進(jìn)行，而是兩種或多種感官同時進(jìn)行。接下來將針對目前高職外貿(mào)函電課堂教學(xué)中所存在的主要問題，從學(xué)生、教師和教材三個方面論述如何構(gòu)建多模態(tài)課堂。

Ct2——對照組目的基因的平均Ct值；

Ct1——對照組內(nèi)參基因的平均Ct值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次，試驗結(jié)果以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示，使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析和處理數(shù)據(jù)，采用Tukey法進(jìn)行差異顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 安石榴苷對細(xì)菌生長的影響

通過菌落計數(shù)得知，起始接菌量為(3.45±0.17)×106CFU/mL。培養(yǎng)24 h后，每個管內(nèi)的菌落數(shù)如表2所示，隨著安石榴苷濃度的增加，金黃色葡萄球菌的數(shù)量減少，安石榴苷以濃度依賴的方式抑制金黃色葡萄球菌的生長，在低于1/8 MIC濃度下，安石榴苷對細(xì)菌生長的影響較小。

2.2 安石榴苷對金黃色葡萄球菌溶血活性的影響

如圖1所示，安石榴苷能夠抑制金黃色葡萄球菌溶血素的產(chǎn)生。安石榴苷處理組的溶血活性與陽性對照組相比顯著降低，且具有極顯著差異，只有在1/4 MIC濃度下與對照組無顯著性差異，該濃度下所表現(xiàn)出的特異性的原因尚不清楚?？傊?，安石榴苷對金黃色葡萄球菌的溶血活性有抑制作用，但抑制作用未呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。溶血素作為一種外毒素是造成金黃色葡萄球菌感染的重要的毒力因子[21]，安石榴苷能夠降低溶血素的表達(dá)，具有潛在的抗感染作用。

表2 菌落計數(shù)Table 2 Cell enumeration CFU/mL

**表示與對照組相比，具有極顯著差異

2.3 安石榴苷對金黃色葡萄球菌凝固酶表達(dá)的影響

向血漿中加入金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液后，每隔1 h輕輕傾斜西林瓶，觀察是否有凝固現(xiàn)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 h后，對照組已完全凝固，1 MIC的安石榴苷處理組未發(fā)生凝固，1/2 MIC，1/4 MIC處理組呈半凝固狀態(tài)，而1/8 MIC和1/16 MIC處理組則完全凝固。連續(xù)觀察至6 h，仍為上述結(jié)果。可見，安石榴苷能夠以劑量依賴的形式抑制金黃色葡萄球菌凝固酶的表達(dá)。血漿凝固酶是一種侵襲性酶，其作用是使血漿中的纖維蛋白在菌體表面沉積和凝固以阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬[22]。安石榴苷能夠降低血漿凝固酶的表達(dá)，從而降低金黃色葡萄球菌的侵襲力。

2.4 安石榴苷對金黃色葡萄球菌總腸毒素表達(dá)的影響

*表示與對照組相比，具有顯著差異；**表示與對照組相比，具有極顯著差異

圖2 安石榴苷對金黃色葡萄球菌腸毒素表達(dá)的影響

Figure 2 Effect of punicalagin on the expression ofS.aureusenterotoxins

2.5 安石榴苷對金黃色葡萄球菌毒力基因表達(dá)的影響

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測后，可見凝膠中均為單一條帶，未發(fā)現(xiàn)非特異性條帶(圖3)，說明每對引物的特異性良好，可用于后續(xù)的RT-PCR反應(yīng)。由圖4可知，每個基因的溶解曲線均為單個峰，再次說明4個基因的引物的特異性較強(qiáng)，擴(kuò)增產(chǎn)物單一。

自左向右依次為100 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、sea、hla、agrA、16S rRNA

圖3 待測基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 3 Agarose gel electrophoresis result of PCR products from genes to be tested

圖4 qRT-PCR溶解曲線Figure 4 qRT-PCR dissociation curves

由圖5可知，當(dāng)安石榴苷的濃度為1/8 MIC時，所檢測基因的相對表達(dá)量均有不同程度的下降，腸毒素基因sea和溶血素基因hla的相對表達(dá)水平分別是對照組的3%，5%，調(diào)節(jié)基因agrA的相對表達(dá)量為對照組的5%，且均與對照組具有極顯著性差異(P<0.01)；在1/16 MIC濃度下，hla的表達(dá)量為對照組的68%，差異極顯著，sea與agrA的表達(dá)量與對照組無顯著性差異。安石榴苷對腸毒素表達(dá)的抑制作用在mRNA水平與蛋白水平上無很好的相關(guān)性，可能是由于mRNA水平代表的是上游轉(zhuǎn)錄因子的激活，而轉(zhuǎn)錄后的修飾、翻譯等一系列過程對腸毒素的表達(dá)量也有直接影響。金黃色葡萄球菌在對數(shù)中后期合成的細(xì)胞膜表面蛋白和胞外蛋白受到由多個元件組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制，本研究中，通過qRT-PCR技術(shù)檢測到安石榴苷對agrA的轉(zhuǎn)錄有抑制作用，故安石榴苷降低毒力因子的表達(dá)部分依賴于agr二元調(diào)控系統(tǒng)。

**表示與對照組相比，具有極顯著差異

3 結(jié)論

安石榴苷以濃度依賴的方式抑制金黃色葡萄球菌的生長，且對溶血素、血漿凝固酶和腸毒素的表達(dá)發(fā)揮明顯的抑制作用。安石榴苷能夠顯著減少α-溶血素的產(chǎn)生，但對溶血素的抑制作用未呈現(xiàn)濃度依賴性；在高于1/4 MIC 濃度下安石榴苷能夠降低血漿凝固酶的表達(dá)，使血漿未發(fā)生明顯凝固；通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)法檢測到在高于1/2 MIC濃度下，安石榴苷能顯著降低總腸毒素的產(chǎn)生量；安石榴苷能顯著抑制腸毒素基因sea、溶血素基因hla和調(diào)節(jié)基因agrA的轉(zhuǎn)錄。然而，安石榴苷在食品介質(zhì)中的抑菌和抗毒力因子表達(dá)的效果尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。