糖通飲與穴位埋線對DPN大鼠血清NGF、TGF-β1的影響

屈璐，侯勝開，高楠楠，潘艷伶

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004；2.棗莊市婦幼保健院，山東 棗莊 277100; 3.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的并發(fā)病之一，也是糖尿病患者致殘的首要因素[1-3]，常以肢體遠端及軀干部分的麻木、疼痛、異樣感、肌肉無力及萎縮等為主要臨床表現(xiàn)。全國名老中醫(yī)凌湘力教授自擬臨床經(jīng)驗方“糖通飲”在治療DPN上取得了較好的臨床療效[4]，但尚未有進一步的機制研究。本實驗即通過動物實驗，初步探討糖通飲及穴位埋線治療DPN大鼠可能的作用機理和途徑，為臨床治療及進一步優(yōu)選治療方案提供客觀的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量(200±20)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCKK(黔)2012-0001。

1.2 儀器與試劑

穩(wěn)豪型血糖儀和血糖試紙(德國羅氏)；BL-420F生理記錄儀(成都泰盟)；鏈脲佐菌霉素(Streptozocin，STZ，美國Sigma)；大鼠神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和ELISA檢測試劑盒(貨號：CK-E30636R、CK-E30643R)(昆明騰昆科技有限公司)。

1.3 動物飼料

動物飼料購置于貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。高能量飼料配方[5]：普通飼料64.9%、煉豬油10%、蔗糖20%、蛋黃5%及食鹽0.1%，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心按上述配方加工生產(chǎn)。

1.4 糖通飲方

組方:黃芪30 g，地骨皮15 g，熟地黃10 g，澤瀉10 g，茯苓10 g，山藥15 g，牡丹皮10 g，草決明20 g，丹參12 g，地龍12 g，雞血藤20 g和路路通10 g。所用中藥飲片均購于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。

2 方法

2.1 分組

75只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組(15只)、模型組(15只)和治療組(45只，中藥組、穴埋組及藥埋組每組各15只)。

2.2 模型制備

模型組及各治療組大鼠給予高能量飼料喂養(yǎng)2周后，使用0.1%STZ按20 mg/kg、30 mg/kg、30 mg/kg的劑量標(biāo)準(zhǔn)進行2～3次腹腔注射，每次注射72 h后取大鼠尾靜脈血檢測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，大鼠FBG值≥16.7 mmol/L[6]，且連續(xù)3天血糖值穩(wěn)定，則判定為造模成功，血糖值未達標(biāo)者進行下一次注射(3次注射后血糖值均未達標(biāo)者，判定模型失敗)。最終納入觀察大鼠為正常組12只，模型組9只，中藥組9只，穴埋組12只，藥理組11只。

2.3 治療方法

中藥組大鼠按8 mL/kg(根據(jù)實驗動物體表面積劑量換算)的劑量標(biāo)準(zhǔn)，給予糖通飲濃縮煎劑灌胃給藥，1次/d；埋線組選取雙側(cè)足三里、肝俞及腎俞穴，常規(guī)消毒后，將0.2 cm羊腸線埋植在穴位皮下組織或肌肉層內(nèi)，1次/2 w。藥埋組將中藥組、穴埋組治療方法結(jié)合進行治療。正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，劑量標(biāo)準(zhǔn)同中藥組，1次/d。中藥干預(yù)治療以5周為1個療程，共進行2個療程；穴位埋線2 w/次，共治療5次。治療期間所有大鼠均采用普通飼料喂養(yǎng)。

2.4 指標(biāo)采集及檢測

2.4.1 坐骨神經(jīng)動作電位傳導(dǎo)速度

大鼠麻醉后俯臥位固定，鈍性分離并暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，采用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)軟件“肌肉神經(jīng)實驗”中“神經(jīng)干興奮傳導(dǎo)速度測定”模塊檢測坐骨神經(jīng)干動作電位傳導(dǎo)速度?？刂茀?shù)：刺激參數(shù)及模式：細電壓，方式：單刺激，延時5.00 ms，波寬0.05，波間隔10，頻率10.0 Hz，強度3.000 V。

2.4.2 NGF、TGF-β1檢測

麻醉大鼠，取大鼠股動脈血5 mL以3 000 r/min離心(4℃)后取上清液，采用ELISA試劑盒檢測。

2.4.3 坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)檢測

麻醉大鼠，俯臥位固定，鈍性分離并暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，截取神經(jīng)節(jié)段放入20%福爾馬林液中固定72 h后，石蠟制片，HE染色后在光鏡下觀察。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況比較

正常組大鼠毛發(fā)光澤，毛色正常，活動靈活，精神、飲食、二便均正常，體質(zhì)量隨周齡增加而增加。造模成功后，模型組及治療組大鼠開始陸續(xù)出現(xiàn)程度不等的體質(zhì)量減輕，飲食、飲水增加，大小便增多，大便溏，毛發(fā)雜亂色枯黃并伴有脫毛。在行動上，模型組及治療組大鼠表現(xiàn)出精神倦怠，少動，行走遲緩，對外界刺激(聲音、觸碰、針刺等)反應(yīng)遲鈍，部分大鼠出現(xiàn)跛行。進行干預(yù)治療后，治療組大鼠進食飲水及二便增多癥狀有所好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量逐漸穩(wěn)定，并有所增加，大鼠毛色、精神、活動等方面均得到不同程度改善。

3.2 各組大鼠血清神經(jīng)生長因子(NGF)及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)水平比較

與正常組比較，模型組大鼠血清NGF含量明顯降低，血清TGF-β1含量明顯增高(P<0.01)。經(jīng)干預(yù)治療后，各治療組大鼠血清NGF含量較模型組明顯升高(P<0.01)，且中藥埋組血清NGF含量升高最為明顯(P<0.01)；各治療組大鼠血清TGF-β1含量均顯著低于模型組(P<0.01)，其中藥埋組血清TGF-β1含量降低最為明顯(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清NGF及TGF-β1含量比較

注：與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01；與藥埋組相比，3)P<0.01。

3.3 各組大鼠空腹血糖及坐骨神經(jīng)動作電位傳導(dǎo)速度比較

與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖明顯升高，且動作電位傳導(dǎo)速度明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，各治療組大鼠FBG值均降低(P<0.05或P<0.01)，其中藥埋組下降最為明顯(P<0.01)。經(jīng)干預(yù)治療后，治療組大鼠坐骨神經(jīng)動作電位傳導(dǎo)速度較模型組均有所升高(P<0.05)，但各治療組間神經(jīng)動作電位傳導(dǎo)速度未見明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠空腹血糖及坐骨神經(jīng)動作電位傳導(dǎo)速度比較

注：與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與藥埋組相比，4)P<0.01。

3.4 各組大鼠坐骨神經(jīng)光鏡檢查情況

正常組大鼠坐骨神經(jīng)切面可見神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)纖維排列規(guī)則整齊，雪旺細胞、髓鞘及軸索結(jié)構(gòu)完整清晰，神經(jīng)束膜組織結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠神經(jīng)纖維排列紊亂，雪旺細胞數(shù)量中度減少、形態(tài)不規(guī)則、部分退變和排列紊亂；髓鞘形態(tài)不規(guī)則、中度水腫，郎飛結(jié)組織結(jié)構(gòu)不清；軸突形態(tài)不規(guī)則、粗細不等及連續(xù)中斷，神經(jīng)束膜血管擴張充血，并伴有少量炎細胞浸潤。治療組大鼠神經(jīng)纖維輕度排列紊亂，雪旺細胞數(shù)量輕度減少，輕度排列紊亂，軸突形態(tài)不規(guī)則、粗細不等及連續(xù)中斷；髓鞘形態(tài)不規(guī)則、輕度水腫，郎飛結(jié)結(jié)構(gòu)較模型組清晰；中藥組和穴埋組神經(jīng)束膜血管輕度擴張充血，并伴有炎細胞浸潤，藥埋組神經(jīng)束膜血管未見明顯擴張充血。見圖1。

圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)HE圖(HE，×100)

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為DPN是代謝紊亂、血管損害、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、氧化應(yīng)激和免疫損傷等多因素共同作用的結(jié)果[7-9]。其中，高血糖是DPN發(fā)病的基礎(chǔ)性因素，研究表明[10-11]，機體血糖長期處于較高水平，不僅會出現(xiàn)微血管病變，雪旺細胞受損，還可導(dǎo)致活性氧自由基、糖基化終產(chǎn)物等產(chǎn)生過多，激活機體多條旁代謝途徑，進而導(dǎo)致神經(jīng)組織功能受損。NGF的缺乏則被認(rèn)為是DPN發(fā)病的主要原因之一[12]，神經(jīng)營養(yǎng)因子學(xué)說認(rèn)為神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成、分泌和代謝障礙是DPN發(fā)病的重要原因，而NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中與神經(jīng)系統(tǒng)活動關(guān)系最密切的一員。研究表明[13-16]，NGF除了對周圍感覺神經(jīng)節(jié)和交感神經(jīng)的生長、維持及存活有重要作用以外，還可促進神經(jīng)中血管的再生和血管活性因子的產(chǎn)生，對加速受損神經(jīng)修復(fù)、促進神經(jīng)功能恢復(fù)、改善患者周圍神經(jīng)癥狀等具有積極作用，因而在DPN的發(fā)病機制和防治中，NGF的作用極其重要。

TGF-β1一直被作為研究糖尿病腎病的重要指標(biāo)[17]，但Anjaneyulu等[18]研究顯示,TGF-β1介導(dǎo)了糖尿病動物模型的周圍神經(jīng)細胞的損傷后，TGF-β1與DPN之間的關(guān)系開始被重視。研究證明[19-22]，TGF-β1可能通過介導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活化、影響谷胱甘肽形成和維持相關(guān)的基因、促進細胞外基質(zhì)積聚等方面參與DPN的發(fā)生發(fā)展,抑制TGF-β1的生成可改善周圍神經(jīng)病變。

中醫(yī)學(xué)中并沒有關(guān)于糖尿病周圍神經(jīng)病變病名的記載，但關(guān)于該病臨床表現(xiàn)的描述可散見于諸多醫(yī)學(xué)文獻中，如《丹溪心法》有“腎虛受之，腿膝枯細，骨節(jié)煩疼”的記載，清代《王旭高醫(yī)案》也記載了消渴患者“消渴日久，但見手足麻木，肢冷如冰”的臨床表現(xiàn)，這些記載都描述了本病具有涼、麻、痛和痿等特點，結(jié)合其發(fā)病機制，可將其歸入中醫(yī)的“消渴痹證”“消渴痿證”等證范疇[23]。

近年來,眾多醫(yī)家分別從陰虛津虧、臟腑虛弱和痰瘀為患等角度對DPN的病因病機進行了深入研究[24-27]，偏重各有不同。全國名老中醫(yī)凌湘力教授則認(rèn)為，該病的基本病機是病久耗傷氣陰，致氣血運行不暢，瘀血阻絡(luò)；或消渴日久,陰損及陽，痰瘀互結(jié)，痹阻脈絡(luò),導(dǎo)致陽氣不能通達四末，肌肉筋脈失于濡養(yǎng)，發(fā)為病，雖其病變在筋脈，但究其內(nèi)涉臟腑乃肝、腎、脾三臟虛損。凌老認(rèn)為，該病病機為肝、脾、腎氣陰不足、痰瘀互結(jié)，具有本虛標(biāo)實的病機特征，其中痰瘀互結(jié)為糖尿病周圍神經(jīng)病變的直接病因，故而在治療上應(yīng)重在滋腎補肝健脾、益氣活血通絡(luò)，并據(jù)此創(chuàng)立糖通飲方。方中重用黃芪益氣活血，熟地黃滋陰補腎、填精益髓，山藥氣陰雙補，一可與黃芪配伍補益脾氣，補后天而充先天，二可與熟地黃相伍滋補肝腎之陰，三者同用并補腎、肝、脾三陰以治本虛，共為君藥；雞血藤、地龍相伍活血通絡(luò)，路路通通經(jīng)化瘀，丹參引藥入心經(jīng)助血上行，四者共用活血化瘀、通經(jīng)疏絡(luò)，共為臣藥；佐藥牡丹皮、地骨皮、澤瀉、茯苓、草決明清熱利濕泄痰濁，一則防陰虛日久生熱，二則防陰損及陽，水津不布，日久生痰濁之弊，全方補虛瀉實，標(biāo)本兼治，祛邪而不傷正，扶正而不斂邪，諸藥合用，共奏滋腎補肝健脾、益氣活血通絡(luò)之效。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實[28-31]，黃芪、山藥、牡丹皮等藥物中的有效成分可以通過調(diào)節(jié)糖、脂代謝，在一定程度上延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展。另有報道[32-33]，熟地黃能明顯促進皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長，具有保護神經(jīng)和抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用；地龍中的水溶性提取物可以顯著激發(fā)NGF生物活性以誘導(dǎo)神經(jīng)軸突增生，也能有效的促進神經(jīng)修復(fù)、再生。

穴位埋線主要是通過埋入羊腸線對穴位產(chǎn)生持久、平和的生理和生物化學(xué)刺激，以調(diào)節(jié)機體臟腑功能。足三里穴位于下肢，是足陽明胃經(jīng)合穴，也是胃的下合穴，既可補益氣血以潤宗筋，又可滋腎健脾，以助消除痰濁瘀血，標(biāo)本兼顧，故選為主穴；腎為消渴發(fā)病之根本，且肝腎同源，腎俞穴可起到培補元氣、滋水涵木、補肝腎之陰精的作用，脾胃為氣血生化之源，脾俞穴具有益氣健脾、化濕泄?jié)嶂?，且與腎俞穴同用可以補后天而充先天，故選取腎俞、脾俞兩穴為配穴。三穴同用可滋肝補腎健脾，以益氣活血、化瘀泄?jié)?，使臟腑氣血通暢、宗筋得養(yǎng)。

本實驗結(jié)果提示,DPN大鼠經(jīng)治療后，F(xiàn)BG、血清NGF、血清TGF-β1含量均較模型組改善，其中藥埋組改善最為明顯，說明中藥糖通飲和穴位埋線均能有效治療DPN，延緩DPN病情進展，兩者合用時療效最佳，值得臨床推廣應(yīng)用，其可能的作用途徑為通過降低血糖，改善糖代謝，增加NGF含量，降低TGF-β1含量，直接或間接促進受損神經(jīng)的生長和修復(fù)，來實現(xiàn)延緩DPN病情進展的目的。