學(xué)科跨界:依托于植物構(gòu)架的組織體外再建和納米醫(yī)學(xué)

摘要：動(dòng)植物跨界交叉應(yīng)用于器官組織工程是利用了植物材料的低免疫源性。這不僅可能徹底解決器官組織再生醫(yī)學(xué)中的關(guān)鍵問(wèn)題——受體移植物免疫排斥性，而且使得植物構(gòu)架在與納米技術(shù)等結(jié)合后可實(shí)現(xiàn)如光合動(dòng)物和植物納米3D打印等科幻般的前沿技術(shù)。

本文對(duì)跨界工作的應(yīng)用性和前景性進(jìn)行了綜述。植物構(gòu)架除了保留了動(dòng)物構(gòu)架的特性和其獨(dú)特優(yōu)越的生物兼容性外，其生產(chǎn)成本低，無(wú)倫理和供給量束縛，操作簡(jiǎn)單，適于大規(guī)模的生產(chǎn)和研究。它的可修飾性以及完整的脈管系統(tǒng)使其適合多種干細(xì)胞的構(gòu)建，促進(jìn)血管生成，在心臟再生生物學(xué)和骨組織再生生物學(xué)等可得到很好的應(yīng)用。植物構(gòu)架可以提供干細(xì)胞增殖分化最佳3D環(huán)境，使其實(shí)現(xiàn)在體器官的構(gòu)建、體外組織的再生或者制藥的體外基礎(chǔ)研究系統(tǒng)。

植物材料特有的低免疫源性的兼容特征使其必將為器官組織工程不可替代的材料，有著不可估量的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：組織再生構(gòu)建;植物構(gòu)架（Scaffold）;水凝膠;納米科學(xué)

一、前言

利用植物構(gòu)建的低免疫源性來(lái)解決器官或組織工程學(xué)中移植物的免疫排斥問(wèn)題，進(jìn)而用于人體解決器官組織再生問(wèn)題具有非常廣闊的應(yīng)用前景。植物構(gòu)架除了保留了動(dòng)物構(gòu)架的特性和其獨(dú)特優(yōu)越的生物兼容性外，其生產(chǎn)成本低，無(wú)倫理和供給量束縛，操作簡(jiǎn)單，適于大規(guī)模的生產(chǎn)和研究。

現(xiàn)今，對(duì)植物構(gòu)架的研究現(xiàn)在才剛剛起步，它在組織工程中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步的完善。在與納米3D熱點(diǎn)技術(shù)、干細(xì)胞、CRISPR基因編輯等技術(shù)結(jié)合后，植物材料特有的低免疫源性的兼容特征使其必將為器官組織工程不可替代的材料，有著不可估量的應(yīng)用前景。

二、植物構(gòu)架大孔徑、高彈力、形狀記憶和可修飾性特性與再生生物學(xué)

（一）植物構(gòu)架與動(dòng)物心臟再生生物學(xué)

心臟組織工程主要是使用功能性生物材料構(gòu)建生物活性構(gòu)架，模仿天然組織形態(tài)和生理功能，進(jìn)而重塑現(xiàn)有心臟組織的移植方案。在心臟組織工程中，植物脫細(xì)胞構(gòu)架較其他構(gòu)架顯現(xiàn)出很好的生物兼容性。植物構(gòu)架擁有完整的細(xì)胞外基質(zhì)和脈管網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而提供干細(xì)胞時(shí)空生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，從而較其他構(gòu)架對(duì)治療更大創(chuàng)傷表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。

1.植物構(gòu)架與細(xì)胞及成體多功能干細(xì)胞

2017年Gaudette團(tuán)隊(duì)以菠菜葉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行的一系列實(shí)驗(yàn)證明了細(xì)胞及多功能干細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)在植物脫細(xì)胞構(gòu)架上的構(gòu)建，與此同時(shí)，Pelling等團(tuán)隊(duì)證明了植物構(gòu)架有明顯的促血管生成作用，從而導(dǎo)致功能性血管在構(gòu)架上的生長(zhǎng)。植物脫細(xì)胞構(gòu)架較動(dòng)物性構(gòu)架脫細(xì)胞化步驟簡(jiǎn)單，且殘余成分低抗源性，生物兼容性好，同動(dòng)物脫細(xì)胞構(gòu)架一樣可供心肌細(xì)胞存活和工作。

2.多種動(dòng)物細(xì)胞在植物構(gòu)架上的復(fù)合細(xì)胞構(gòu)建

在動(dòng)物及人體中，每一個(gè)器官組織都是由多種細(xì)胞在發(fā)育中漸行分化特異形成，因而細(xì)胞在植物構(gòu)架上組織構(gòu)建也必然是多種細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建而成，也正因?yàn)槿绱?，多功能干?xì)胞的應(yīng)用正好順應(yīng)該條件需求。用于再細(xì)胞化的種子細(xì)胞通常使用多種細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞等。植物構(gòu)架可供多種可用于再細(xì)胞化的干細(xì)胞存活和增殖，在器官構(gòu)建中，各種干細(xì)胞被接種到器官構(gòu)架上。

（二）植物構(gòu)架與骨組織再生構(gòu)建

1.植物構(gòu)架與軟骨構(gòu)建

植物構(gòu)架用于軟骨構(gòu)建大都為植物纖維素制成的注射型水凝膠，也是最早的骨組織工程構(gòu)建研究領(lǐng)域。2018年發(fā)表的一項(xiàng)研究將植物來(lái)源的多糖羧甲基纖維素（CMC）硫酸化，結(jié)合以往的研究結(jié)果將其與明膠共同制備成可用于注射的大孔構(gòu)架。該植物構(gòu)架以其特有的形狀記憶特性和其對(duì)生長(zhǎng)因子的粘附力，有效模擬了軟骨修復(fù)的天然軟骨再生的復(fù)雜性過(guò)程。英國(guó)皇家學(xué)院Stevens等科學(xué)研究者在前人的工作基礎(chǔ)上，于2016年使用重組鏈球菌膠原樣蛋白和三種促軟骨形成多肽序列構(gòu)建骨架，而后與基質(zhì)金屬蛋白酶（mmp7）和聚蛋白多糖酶（ADAMT-S4）按一定的比例交聯(lián)形成可生物降解的水凝膠。這種交聯(lián)構(gòu)建使人間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的軟骨形成特征，這些研究為人類(lèi)軟骨再生和修復(fù)提供了成本低的植物材料構(gòu)建體系，并為骨骼動(dòng)力學(xué)功能研究提供了體外模式。

2.植物構(gòu)架與成骨細(xì)胞活性

美國(guó)內(nèi)布拉斯加大學(xué)林肯分校的Yang 等發(fā)現(xiàn)小麥麥谷蛋白膜顯示出了較聚乳酸PLA膜更好的成骨細(xì)胞增殖特性。他將麥谷蛋白、麥醇溶蛋白和兩者混合而成的小麥面筋分別加工成膜，并與聚乳酸PLA膜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)麥谷蛋白明顯有益于成骨細(xì)胞的粘附和增殖，以及有著優(yōu)于PLA膜更廣泛的flagella化。這說(shuō)明小麥麥谷蛋白若與上述其他構(gòu)架材料共同使用獲得的復(fù)合材料，可能成為組織工程中優(yōu)良的動(dòng)植物復(fù)合構(gòu)架。

（三）植物構(gòu)架的可修飾性

器官組織的植物構(gòu)架易于應(yīng)用基因修飾技術(shù)，過(guò)表達(dá)目標(biāo)基因表達(dá)出特定修飾的植物源動(dòng)物蛋白，從而使植物構(gòu)架兼容動(dòng)物細(xì)胞構(gòu)架必要特質(zhì)，使種子細(xì)胞生長(zhǎng)分化構(gòu)建成器官組織。

Shilo等將基于轉(zhuǎn)基因煙草生產(chǎn)的重組人源膠原蛋白（rhCollagen）的凝膠制劑注入到大鼠急性全厚度皮膚傷口愈合模型中。相較于牛膠原蛋白和人體皮膚膠原蛋白，rhCollagen凝膠制劑加速了傷口的閉合，并引發(fā)了愈合過(guò)程的啟動(dòng)，伴有更強(qiáng)烈的再上皮化，觀察到了早期血管生成反應(yīng)和減少的炎癥反應(yīng)，這種治療可能會(huì)對(duì)較深的傷口有利，從而可以縮短愈合時(shí)間。這為慢性傷口的愈合提供了組織工程學(xué)生物兼容性好、低成本的材料。植物構(gòu)架不僅保持了動(dòng)物源構(gòu)架的優(yōu)異性能，而且制備更加方便，操作工序簡(jiǎn)單，造價(jià)低。相較天然牛膠原蛋白，只引起極低的免疫反應(yīng)。

三、現(xiàn)代納米技術(shù)使植物構(gòu)架提供動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)分化的組織工程3D環(huán)境

納米技術(shù)是當(dāng)今材料科學(xué)令人注目的學(xué)科，近年來(lái)它的發(fā)展成為加速現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的關(guān)鍵。器官組織工程學(xué)與納米技術(shù)的結(jié)合，使得植物構(gòu)架為干細(xì)胞提供更加精密的3D環(huán)境，為其增殖、遷移和分化提供更為精準(zhǔn)的調(diào)控。

使用納米技術(shù)改良的植物構(gòu)架可改善種子細(xì)胞的增殖、粘附和分化已被赫爾辛基大學(xué)的研究人員以及Korrapati等科學(xué)工作者證實(shí)，眾多研究從機(jī)理上證明了納米級(jí)精密形貌結(jié)構(gòu)更利于細(xì)胞和干細(xì)胞的粘附、增殖和遷徙。

利用納米多孔3D植物構(gòu)架，科技工作者制備了良好互通的納米孔構(gòu)架，并應(yīng)用于骨骼的構(gòu)建。上海東方醫(yī)院的Wu等將納米多孔透輝石生物玻璃（nDPB）添加于醇溶蛋白的基質(zhì)中，通過(guò)溶液壓縮和顆粒浸出的方法制備了大納米多孔植物構(gòu)架，分別進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。此納米孔構(gòu)架上，nDPB對(duì)MC3T3-E1在構(gòu)架上的粘附和生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用與其含量正相關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，nDPB也可改善成骨特性和可降解性，I型膠原蛋白的表達(dá)明顯增加，表明骨形成良好。依據(jù)臨床需要，植物構(gòu)架也可以提供2D細(xì)胞環(huán)境應(yīng)用于組織工程。

四、現(xiàn)代納米技術(shù)等使植物構(gòu)架成為有效制藥的體外基礎(chǔ)研究系統(tǒng)

器官組織工程學(xué)的發(fā)展已經(jīng)進(jìn)入到新的時(shí)期，大量的研究報(bào)道已經(jīng)把納米技術(shù)作為構(gòu)建植物構(gòu)架的基本技術(shù)，因而以下總結(jié)的研究工作包括心肌組織再生、藻類(lèi)和動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)合嵌合組織功能檢測(cè)和干細(xì)胞納米3D打印等，均以納米級(jí)別的植物構(gòu)架上接種細(xì)胞而獲得。

（一）植物構(gòu)架用于心臟構(gòu)建再生元件供氧研究的模型

組織工程臨床使用的重要問(wèn)題是所構(gòu)建組織的氧供應(yīng)問(wèn)題，而通常構(gòu)架氧氣的供應(yīng)范圍非常局限。目前針對(duì)這個(gè)問(wèn)題而開(kāi)發(fā)的技術(shù)有高壓氧法、全氟化碳（PFC）技術(shù)和過(guò)氧化物法等。高壓氧法伴隨細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)，效果較差;全氟化碳無(wú)法提供持續(xù)釋放的氧氣;過(guò)氧化物法有細(xì)胞毒性。俄亥俄州立大學(xué)使用可注射快速凝膠化的水凝膠混合電噴霧制備的釋放氧氣的微球制成輸氧系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)評(píng)估在供氧能力上有較大的改觀，在低氧條件下心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞的存活均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增長(zhǎng)。2016年，Egana等將轉(zhuǎn)入了血管內(nèi)皮生成因子VEGF的綠藻細(xì)胞接種于生物活性構(gòu)架上，建立了光合自養(yǎng)構(gòu)架系統(tǒng)，為解決供氧難題打開(kāi)了新的思路。

2017年日本Teruo將綠藻與大鼠心肌細(xì)胞或小鼠C2C12心肌細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，創(chuàng)建了重構(gòu)三維組織。綠藻細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧氣提供給較厚的心臟細(xì)胞層的細(xì)胞，使其從無(wú)氧呼吸改變?yōu)橛醒鹾粑?，顯示出良好的組織狀態(tài);同時(shí)伴隨乳酸鹽和氨的產(chǎn)生量顯著降低，以及心肌細(xì)胞損傷的CK釋放量顯著降低。該復(fù)合植物構(gòu)架在體外培養(yǎng)出了更厚的心臟組織的詳盡實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，新型綠藻植物3D構(gòu)架很有可能為解決組織工程中因血管化不足導(dǎo)致的缺氧問(wèn)題，提供了極為有效的解決方式。

（二）體外構(gòu)建再生元件的免疫學(xué)研究

正如前面討論的一樣，體外構(gòu)建的光合自養(yǎng)構(gòu)架除具有優(yōu)秀的生物兼容性外，是否具有良好的非免疫源性也將是決定這種光合自養(yǎng)構(gòu)架是否能能夠真正應(yīng)用于臨床的決定因素。2015年Egana等使用纖維蛋白水凝膠為載體，將單細(xì)胞綠藻接種于整合構(gòu)架，在持續(xù)光照室溫下培養(yǎng)3天，移植于小鼠體內(nèi)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，綠藻的存在不會(huì)引發(fā)小鼠的天然免疫反應(yīng)，且可在體內(nèi)存活5天以上，該構(gòu)架形態(tài)結(jié)構(gòu)完整細(xì)胞有活性，并產(chǎn)生了由藻類(lèi)和鼠類(lèi)細(xì)胞組成的嵌合組織。次年，他將血管內(nèi)皮生成因子VEGF的綠藻細(xì)胞種植于整合構(gòu)架上，移植于免疫系統(tǒng)正常的小鼠內(nèi)，該構(gòu)架在免疫系統(tǒng)正常的小鼠內(nèi)沒(méi)有引起顯著的免疫應(yīng)答和炎癥。他們的研究結(jié)果明確表明，綠藻光合自養(yǎng)構(gòu)架有不可估量的應(yīng)用前景。

（三）光合脊椎動(dòng)物的實(shí)質(zhì)性探索研究

有未來(lái)學(xué)預(yù)測(cè)，動(dòng)物學(xué)和植物學(xué)學(xué)科交叉可能出現(xiàn)科幻影片中的光合脊椎動(dòng)物，也就是經(jīng)過(guò)生物工程的改造，包括人類(lèi)脊椎動(dòng)物在內(nèi)的動(dòng)物個(gè)體可以像植物那樣從陽(yáng)光中獲取能量。近年來(lái)，實(shí)質(zhì)性探索研究使人感覺(jué)到這類(lèi)學(xué)科交叉不再停留在科幻的領(lǐng)域。Egana等在2015年將單細(xì)胞綠藻注入斑馬魚(yú)卵中，檢測(cè)兩種生物的相互作用和活力。他們發(fā)現(xiàn)，綠藻細(xì)胞分布于斑馬魚(yú)不同的組織中，進(jìn)而形成魚(yú)藻嵌合體。進(jìn)一步的檢測(cè)證明藻類(lèi)在斑馬魚(yú)中存活并保持代謝功能至少3天，且綠藻在魚(yú)類(lèi)中并沒(méi)有引發(fā)炎癥。雖然高濃度的藻類(lèi)會(huì)引起斑馬魚(yú)卵的死亡（這可能是藻類(lèi)對(duì)早期魚(yú)類(lèi)發(fā)育的物理干擾造成的）。此項(xiàng)研究為光合脊椎動(dòng)物的設(shè)計(jì)成為現(xiàn)實(shí)提供最初但鼓舞人心的實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。

（四）納米技術(shù)3D打印、干細(xì)胞發(fā)育分化體系與植物構(gòu)架的聯(lián)合

植物構(gòu)架作為具有眾多優(yōu)勢(shì)的器官組織過(guò)程體系，由于具有易于體外操作的特性，可以與眾多現(xiàn)代革命性技術(shù)相聯(lián)合，彰顯出重大的應(yīng)用前景。今年，清華大學(xué)使用羥丙基幾丁質(zhì)作為生物墨水的3D細(xì)胞印刷技術(shù)對(duì)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，該研究揭示了非離子交聯(lián)bioink的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)材料HPCH，包括高凝膠強(qiáng)度和hiPSC印刷中的快速溫度響應(yīng)，并首次實(shí)現(xiàn)了底漆狀態(tài)hiPSC印刷。在該研究中實(shí)現(xiàn)的特征，例如高細(xì)胞產(chǎn)量，高多能性維持和均勻聚集，為進(jìn)一步的關(guān)于3D微組織分化和藥物篩選的hiPSC研究提供了良好的基礎(chǔ)。

五、結(jié)論與展望

植物構(gòu)架不僅有動(dòng)物性構(gòu)架的特性提供干細(xì)胞所需的3D環(huán)境和脈管系統(tǒng)，而且它具有非常優(yōu)秀的免疫兼容性和可修飾性，使之應(yīng)用于心臟組織工程和骨工程等領(lǐng)域，適用于多種干細(xì)胞的增殖和分化，并且同時(shí)能夠促進(jìn)血管發(fā)育和分化。納米級(jí)精細(xì)結(jié)構(gòu)的植物構(gòu)架用于在體器官或組織的再生和體外組織的再生研究和臨床應(yīng)用提供了不可多得的精密器官組織工程材料。

植物構(gòu)架應(yīng)用于器官組織工程的研究尚屬于初級(jí)階段，植物組織材料具有的幾大特點(diǎn)為之奠定了應(yīng)用基礎(chǔ)。（一）植物結(jié)構(gòu)成分的多樣性。對(duì)于脫細(xì)胞材料，不同器官的構(gòu)建需要相應(yīng)適合的材料。如菠菜葉的葉脈結(jié)構(gòu)更適合如心臟組織的高度血管化的器官，而鳳仙花莖的圓柱形中空結(jié)構(gòu)可能更適合作為動(dòng)脈移植物構(gòu)架。（二）有些植物蛋白或多糖作為構(gòu)架需要通過(guò)基因表達(dá)進(jìn)行蛋白修飾或純化，植物構(gòu)架在這方面也顯示了其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。（三）各類(lèi)蛋白最適環(huán)境不同，導(dǎo)致植物構(gòu)架適合酸性環(huán)境。所以植物構(gòu)架蛋白或多糖適合性尚需更多的基礎(chǔ)研究來(lái)揭示。（四）植物構(gòu)架制備獲取的材料處理的方法尚待完善，特別是構(gòu)建納米級(jí)微環(huán)境，無(wú)論是體外還是在體應(yīng)用都需要更多交叉學(xué)科的介入。植物構(gòu)架具有諸多優(yōu)于動(dòng)物性構(gòu)架的特性，它修飾性好且無(wú)污染和無(wú)病原;成本低且制作流程簡(jiǎn)單，適用于大規(guī)模的生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究。隨著納米級(jí)微環(huán)境植物構(gòu)架的不斷完善，結(jié)構(gòu)記憶性和3D打印方式的引入，其獨(dú)到的低免疫源性的兼容特征使其必將為器官組織工程不可替代的精密材料。

參考文獻(xiàn)：

[1]Luo CJ.，et al.，A 3-dimensional fibre scaffold as an investigative tool for studying the morphogenesis of isolated plant pells. BMC Plant Biol，2015.15：p.211.

[2]Babitha S.，Korrapati PS. Biodegradable zein-polydopamine polymeric scaffold impregnated with TiO2 nanoparticles for skin tissue engineering. Biomed Mater，.2017.12（5）：p.055008.

[3]Waghmare NA.，et al.，Sulfated polysaccharide mediated TGF-a1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydr Polym， 2018.193：p.62-72.

[4]Gershlak JR.，et al.，Crossing kingdoms： Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds.Biomaterials，2017.125：p.13-22

[5]Scarritt ME.，Pashos NC.， Bunnell BA. A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs. Front Bioeng Biotechnol，2015.3：p.43.

[6]Guyette JP.，et al.，Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circ Res，2016.118（1）：p.56-72.

（作者系陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在讀碩士）