桑黃黃酮、多糖高產(chǎn)優(yōu)良菌株的篩選試驗(yàn)

謝春芹 楊鶴同 吳琴燕

摘要：為了篩選出黃酮和多糖產(chǎn)量較高的優(yōu)良桑黃菌株，對(duì)17株桑黃菌株的生物量、黃酮和多糖含量及總產(chǎn)量進(jìn)行分析，采用酵母提取物麥芽糖完全培養(yǎng)基（CYM）液體培養(yǎng)基對(duì)17株不同的桑黃菌株發(fā)酵培養(yǎng)7 d，收集液體菌絲，烘干至恒質(zhì)量后測(cè)定菌絲干質(zhì)量，用NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定菌絲黃酮含量，用苯酚-硫酸法測(cè)定菌絲多糖含量。結(jié)果表明：在17株桑黃菌株中，生物量最大的是JNSH-14，達(dá)到0.645 g/100 mL;黃酮產(chǎn)量最大的是JNSH-15，達(dá)到42.048 mg/L;多糖產(chǎn)量最大的是JNSH-15，達(dá)到834.146 mg/L。由研究結(jié)果可以看出，JNSH-15菌株無論是在生物量還是總黃酮、總多糖產(chǎn)量方面，都處于較高水平。研究結(jié)果可為下一步桑黃黃酮、多糖發(fā)酵工藝優(yōu)化中發(fā)酵菌株的選擇提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桑黃;黃酮;多糖;菌株

中圖分類號(hào)： S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0209-04

桑黃（Phellinus spp.）在分類學(xué)上屬于真核真菌亞界（Eukaryomycota）真菌門（Eumycota）擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）多孔菌目（Polyporales）銹革孔菌科（Hymenochaetacae）針層孔菌屬（Phellinus）[1]，在我國(guó)有著悠久的應(yīng)用歷史，最早在李時(shí)珍所著的《本草綱目》中就已經(jīng)有了關(guān)于桑黃的記載，常用于治療內(nèi)臟下垂、脫肛瀉血、血崩氣血兩虛等癥狀[2-4]。日本學(xué)者IkeKawa等在1968年研究發(fā)現(xiàn)，桑黃（Phellinus linteus）子實(shí)體提取物具有非常好的抗癌效果，對(duì)小鼠肉瘤S180的抑制率可達(dá)96.7%，對(duì)正常細(xì)胞無毒害作用[5-6]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，桑黃提取物對(duì)小鼠肝癌H22、肉瘤s180、肺癌Lewis[7]、腦膠質(zhì)瘤U251[8]、乳腺癌細(xì)胞MCF-7[9]、人源性結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29[10]等均有良好的抗瘤作用，同時(shí)可以提高人體免疫能力，保護(hù)肝臟，治療關(guān)節(jié)炎等[11-12]。這些都使得桑黃的研究成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，使其在藥品研發(fā)與臨床應(yīng)用領(lǐng)域以及保健品開發(fā)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

桑黃廣泛的藥理功能得益于其多種多樣的化學(xué)成分，現(xiàn)代生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桑黃的主要化學(xué)成分有多糖、黃酮、香豆素、氨基酸、萜類物質(zhì)和酚類物質(zhì)等，其中具有較強(qiáng)生物學(xué)活性的有效成分主要是多糖、黃酮和三萜等[13-14]，其中又以多糖、黃酮的研究最為系統(tǒng)。多糖存在于子實(shí)體、菌絲體和發(fā)酵液中，分為子實(shí)體多糖、菌絲體胞內(nèi)多糖（intracellular polysaccharide，簡(jiǎn)稱IPS）和胞外多糖（extracellular polysaccharide，簡(jiǎn)稱EPS）[15-16]，具有抗腫瘤、提高免疫力、降血糖等功效[2]。子實(shí)體多糖以雜多糖為主，研究發(fā)現(xiàn)的主要單糖有甘露糖、半乳糖、葡萄糖、樹膠醛糖、果糖、木糖[17-18]。黃酮類化合物是桑黃抗氧化作用的重要物質(zhì)，總黃酮含量可作為桑黃抗氧化效用的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[19]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑黃黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗肝纖維化、增強(qiáng)免疫的作用[20-21]。

本研究通過液體發(fā)酵培養(yǎng)，比較17株桑黃菌株的生物量和黃酮、多糖含量，從中篩選出桑黃黃酮、多糖總產(chǎn)量較高的菌株，以期為生產(chǎn)上桑黃的液體發(fā)酵高效生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 17株桑黃菌株（JNSH-1～JNSH-17）保存于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室，各類菌株的來源見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌種活化用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基[22]，配方如下：200 g馬玲薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，1 000 mL水。配制方法同常規(guī)，裝量為8 mL/平皿（直徑為5 cm），倒板后冷卻，備用。

種子液體培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基，配方如下：200 g馬玲薯，20 g葡萄糖，1 000 mL水。配制方法同常規(guī)，裝量為 100 mL/瓶（三角瓶容量為250 mL），滅菌后冷卻，備用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基為CYM（酵母提取物麥芽糖完全培養(yǎng)基），配方如下：10 g麥芽糖，20 g葡萄糖，2 g酵母提取物，2 g 蛋白胨，0.5 g MgSO4·7H2O，4.6 g KH2PO4，1 000 mL去離子水。配制方法同常規(guī)，裝量為100 mL/瓶（三角瓶容量為250 mL），滅菌后冷卻，備用。

1.1.3 試劑與溶液 主要試劑有5% NaNO2、濃硫酸、70%乙醇、10%葡萄糖、Al（NO3）3、蕓香苷（純度>95%）、4% NaOH、6%苯酚。

1.1.4 儀器設(shè)備 主要儀器設(shè)備有28 ℃恒溫培養(yǎng)箱、烘箱、722型可見分光光度計(jì)、分析天平、天平、小型種子打碎機(jī)、搖床、超聲波清洗儀、超凈臺(tái)、臺(tái)式高速離心機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、酶標(biāo)儀等[22]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種平板的活化 從冰箱保存的斜面試管菌種（母種）中挑取1小塊菌餅塊，接種于PDA固體平板培養(yǎng)基中央，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 桑黃一級(jí)種的制備 用250 mL三角瓶分裝PDA液體培養(yǎng)基，每瓶裝100 mL，高壓滅菌后使用。用直徑為6 mm的無菌打孔器在活化的平板菌種上選取活力較高的靠近菌絲邊緣的菌絲打孔[19]，挑取8塊帶有培養(yǎng)基的菌絲接種于三角瓶?jī)?nèi)，于150 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d。

1.2.3 二級(jí)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 用250 mL三角瓶分裝CYM液體培養(yǎng)基，每瓶裝100 mL，高壓滅菌后使用。將制備好的一級(jí)種在無菌條件下用組織勻漿破碎機(jī)打碎，按4%的接種量接種到CYM液體培養(yǎng)基中，于150 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d。

1.2.4 菌絲生物量的測(cè)定 發(fā)酵培養(yǎng)7 d后，將菌絲球用20目篩網(wǎng)收集起來，于清水下沖洗，直至培養(yǎng)基完全被洗凈，再將菌絲平攤于已稱質(zhì)量的無紡布上，在烘箱中于60 ℃烘干，稱量此時(shí)的質(zhì)量，得到菌絲干質(zhì)量。

1.2.5 黃酮含量的測(cè)定 精確稱取0.05 g菌絲粉末，加入 5 mL 70%乙醇，放入超聲清洗機(jī)中超聲1 h，獲得萃取液。取1 mL提取液，用NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定黃酮含量。用0.1 mg/mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算桑黃中的黃酮含量[22]。

1.2.6 胞內(nèi)多糖含量的測(cè)定 將菌絲烘干研磨成粉末后，精確稱取0.05 g粉末，加入5 mL 1 mol/L NaOH溶液，沸水浴 1 h，吸取提取液備用。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，用1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[23-24]。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每組試驗(yàn)都以3組生物學(xué)重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”作為最終結(jié)果。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重比較分析，不同小寫字母代表在0.05水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 17株桑黃菌株菌絲干質(zhì)量的比較

用CYM培養(yǎng)基對(duì)17株不同的桑黃菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定菌絲干質(zhì)量。如圖1所示，不同菌株間的生物量差異較大，在0.054 ～0.645g/100 mL之間;生物量較高的菌株有JNSH-14、JNSH-15、JNSH-1、JNSH-9、JNSH-5、JNSH-2，分別達(dá)到6.45、5.87、5.44、4.65、4.34、4.18 g/L。

2.2 17株桑黃菌株菌絲黃酮含量的比較

如圖2所示，17株桑黃菌株的黃酮含量有一定差異，在0.116 ～0.717mg/100 mg之間。黃酮含量較高的菌株有JNSH-15、JNSH-2、JNSH-5，分別達(dá)到0.717、0.589、0.532 mg/100 mg。

2.3 17株桑黃菌株菌絲多糖含量的比較

如圖3所示，17株桑黃菌株的多糖含量差異相對(duì)較小，在6.778 ～15.876mg/100 mg之間。桑黃多糖含量較高的菌株有JNSH-8、JNSH-12、JNSH-15，分別達(dá)到15.876、15.106、14.218 mg/100 mg。

2.4 17株桑黃菌株菌絲總黃酮產(chǎn)量的比較

為了綜合比較各桑黃菌株的產(chǎn)黃酮特性，計(jì)算17株桑黃菌株的總黃酮產(chǎn)量。如圖4所示，JNSH-15菌株的總黃酮產(chǎn)量最高，達(dá)到42.048 mg/L;JNSH-2、JNSH-5、JNSH-14的總黃酮產(chǎn)量較高，分別達(dá)到24.645、23.086、20.634 mg/L;其他桑黃菌株的總黃酮產(chǎn)量較低。

2.5 17株桑黃菌株菌絲總多糖產(chǎn)量的比較

為了綜合比較各桑黃菌株產(chǎn)多糖的特性，計(jì)算17株桑黃菌株的總多糖產(chǎn)量。如圖5所示，JNSH-15菌株的桑黃總多糖產(chǎn)量最高，達(dá)到834.146 mg/L;JNSH-1、JNSH-2、JNSH-8的總多糖產(chǎn)量較高，分別達(dá)到665.822、553.897、528.135 mg/L;其他桑黃菌株的總多糖產(chǎn)量較低。

3 結(jié)論

不同桑黃菌株類別對(duì)活性物質(zhì)產(chǎn)量有著非常重要的影響。本研究首先進(jìn)行初始菌株的篩選，從17株不同的桑黃菌株（JNSH-1～JNSH-17）中篩選出1株活性物質(zhì)總產(chǎn)量最高的菌株。黃酮、多糖作為桑黃藥用組成中最為重要、研究得最為系統(tǒng)的2種成分，其產(chǎn)量的高低影響著桑黃的價(jià)值[24-25]。因此，本研究選擇黃酮、多糖這2種活性物質(zhì)的產(chǎn)量作為評(píng)判桑黃菌株優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)，從而篩選出最優(yōu)的桑黃菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，篩選出的JNSH-15菌株在菌絲干質(zhì)量、黃酮及多糖產(chǎn)量方面均處于較高水平，綜合考慮，將其作為液體發(fā)酵生產(chǎn)的最優(yōu)菌株。

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