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    余甘子主要活性成分柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

    2019-09-23 06:10:53瞿運秋趙文佳陳繼光
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年14期

    瞿運秋 趙文佳 陳繼光

    摘要:前期從余甘子中分離鑒定了一系列對α-葡萄糖苷酶有較好抑制活性的沒食子單寧成分,柯里拉京為其中的1個主要活性成分,本試驗進(jìn)一步對柯里拉京抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用機制進(jìn)行了研究。采用體外微量96孔板α-葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)模型測定了柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制活性,并進(jìn)行了抑制動力學(xué)試驗,以非線性擬合法分析了其對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)參數(shù),同時采用分子對接模型研究了柯里拉京與α-葡萄糖苷酶相互作用的機制。結(jié)果表明,柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50為15.33 μmol/L,顯著低于陽性對照阿卡波糖的IC50(79.88 μmol/L);非線性擬合結(jié)果發(fā)現(xiàn),柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為混合型抑制;氫鍵是柯里拉京與α-葡萄糖苷酶之間相互結(jié)合的主要作用力。結(jié)果為柯里拉京作為降糖保健品或藥品開發(fā)提供了理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:余甘子;柯里拉京;α-葡萄糖苷酶;酶動力學(xué);酶抑制;分子對接

    中圖分類號: R285.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號:1002-1302(2019)14-0206-03

    以胰島素抵抗為特征的Ⅱ型糖尿病占糖尿病發(fā)病總數(shù)90%以上,我國Ⅱ型糖尿病的患病人數(shù)占總?cè)丝?0%左右,成為全球糖尿病患病人數(shù)第二大國[1]。糖尿病主要對眼睛、腎臟、神經(jīng)心血管、下肢血管等造成損害并發(fā)癥,甚至導(dǎo)致多器官功能衰竭,因此針對糖尿病的治療主要以控制血糖水平,預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生為主。以阿卡波糖為代表的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有很好地控制餐后血糖水平的功效,是臨床常用的治療糖尿病藥物。

    α-葡萄糖苷酶是存在于小腸絨毛膜上的一組酶系,能夠催化食物中淀粉、蔗糖和麥芽糖等多糖、寡糖和二糖水解為可吸收的單糖(葡萄糖和果糖)。α-葡萄糖苷酶的抑制劑通過競爭抑制α-葡萄糖苷酶活性,延緩多糖、寡糖和二糖向單糖的轉(zhuǎn)化,控制餐后血糖濃度[2]。最近幾年,以α-葡萄糖苷酶為作用靶點,從藥用、可食性植物或微生物中篩選活性成分是研究熱點[3-6]。對α-葡萄糖苷酶有抑制作用的植物活性成分主要包括萜類、生物堿、醌類、黃酮、多酚、苯丙烷和類固醇化合物等[7]。多酚類化合物可以通過多途徑抑制α-葡萄糖苷酶活性,金銀花花蕾中3,5-二咖啡??鼘幩嵬ㄟ^非競爭性抑制小腸α-葡萄糖苷酶活性[8];然而,劉雪輝等對從紫甘薯莖葉中分離的4個高純度咖啡?;鼘幩犷愃莆铮ňG原酸、4,5-O-咖啡?;鼘幩帷?,5-O-咖啡?;鼘幩峒?,4-O-咖啡?;鼘幩幔┮种痞?葡萄糖苷酶活性機制進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,這些物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭性抑制[9]。因此對同一個化合物抑制α-葡萄糖苷酶機制進(jìn)行研究,不同的學(xué)者會得出不同的結(jié)論,筆者所在課題組前期通過5種方法對阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)地分析,結(jié)果表明,非線性擬合法更加簡便、合理及可靠,可以是研究酶促動力學(xué)的首選方法[10]。

    余甘子為大戟科葉下珠屬植物的干燥成熟果實,有機酸類物質(zhì)是其主要成分,前期從余甘子降血糖活性部位分離鑒定出7個酚類活性成分,均具有很好的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用[11],尤其是沒食子酸和柯里拉京活性最強??吕锢┦且环N逆沒食子酸鞣質(zhì),主要存在于龍眼核、余甘子、葉下珠全草、龍眼殼、欖仁樹葉和纖梗葉下珠全草等植物中[12],具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗血栓、抑制病毒、抗菌、抗炎、降血壓等藥理作用,具有很大的藥用前景[13]。《中華人民共和國藥典》(2015版)規(guī)定沒食子酸為評價余甘子質(zhì)量的指標(biāo)成分,目前有較多學(xué)者報道增加多酚類成分柯里拉京為余甘子的另一個質(zhì)控指標(biāo)。

    為了進(jìn)一步探討柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用機制,本研究采用非線性擬合法對其抑制α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用分子對接技術(shù),初步探討其作用α-葡萄糖苷酶的主要作用位點,以期確定其抑制 α- 葡萄糖苷酶的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    α-葡萄糖苷酶,購自美國Sigma公司;4-硝基苯基-α-D- 吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG),購自美國Sigma公司;阿卡波糖(Acarbose),購自廣東省廣州市億邦醫(yī)藥科技有限公司;對硝基苯酚(PNP),購自上海展云化工有限公司;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀(國產(chǎn)分析純),購自西隴化工股份有限公司;甘油(國產(chǎn)分析純),購自上海瑞楚生物科技有限公司;實驗用水均為超純水。

    1.2 主要儀器

    SpectraMax M2型酶標(biāo)儀,美國分子儀器有限公司(Molecular Devices);HH60型數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱,江蘇南京溫諾儀器設(shè)備有限公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 試劑的配制 PBS(磷酸鹽緩沖液):稱取4.559 g KH2PO4和7.646 g K2HPO4·3H2O,以去離子水定容至 500 mL,調(diào)節(jié)pH值至6.8,121 ℃滅菌20 min,4 ℃貯存?zhèn)溆?α-葡萄糖苷酶:將α-葡萄糖苷酶凍干粉溶于含50%甘油的磷酸鹽緩沖液(pH值6.8),配制成100 U/mL的酶溶液,分裝,-20 ℃凍存?zhèn)溆?PNPG、PNP、阿卡波糖均以磷酸緩沖液配制,置于4 ℃冰箱冷藏備用。

    1.3.2 PNP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取不同體積的PNP標(biāo)準(zhǔn)品溶液于96孔板中,以PBS補足至200 μL,配成0、0.03、0.06、0.15、0.30、0.60、1.50、3.00、6.00、12.00、24.00、48.00、96.00 nmol的系列PNP標(biāo)準(zhǔn)品溶液,于405 nm處測定吸光度,重復(fù)測定4次。以吸光度(D)為橫坐標(biāo),PNP的物質(zhì)的量為縱坐標(biāo),繪制測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定方法 以微量的96孔板α-葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)體系為模型進(jìn)行檢測,具體操作如下:依次往各反應(yīng)孔中加入PBS、α-葡萄糖苷酶(1 U/mL)5 μL、待測抑制劑樣品10 μL,混勻后置于37 ℃水浴中孵育20 min;加入16 μL的PNPG(2.5 mmol/L),置于 37 ℃ 水浴中反應(yīng)6 min,于405 nm波長下測定吸光度,重復(fù)檢測3次,每次設(shè)4個平行處理。以阿卡波糖為陽性對照物,濃度設(shè)為1.0 mmol/L;待測抑制劑設(shè)5、10、20、40、80 μmol/L 5個濃度梯度。

    酶活抑制率=(D空白-D樣品)/D空白×100%。

    式中:D空白為未加抑制劑組的吸光度;D樣品為待測抑制劑組的吸光度。采用Graphpad prism 5.0軟件處理試驗數(shù)據(jù),計算待測抑制劑的半抑制濃度(IC50)。

    1.3.4 抑制劑抑制動力學(xué)檢測方法 基于微量的96孔板 α- 葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)體系進(jìn)行檢測,具體操作如下:依次往各反應(yīng)孔中加入PBS、α-葡萄糖苷酶(1 U/mL)5 μL和待測抑制劑溶液10 μL(以阿卡波糖陽性對照物),混勻后置于37 ℃水浴中孵育20 min;每孔分別加入0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500、0.600、0.800、1.000 mmol/L 的PNPG,于 37 ℃ 水浴中反應(yīng)6 min,405 nm波長下測定吸光度,計算反應(yīng)速度,重復(fù)檢測3次。采用Origin 8.4軟件,以底物濃度(S)為自變量、反應(yīng)速度(v)為因變量進(jìn)行非線性擬合,計算抑制劑作用下反應(yīng)體系的表觀vmax和表觀Km,并通過方差分析來判斷vmax和Km的差異顯著性,據(jù)此確定待測抑制劑的抑制作用類型。

    1.3.5 酶與抑制劑分子對接方法 參照王雪潔等的方法[14]進(jìn)行分子對接模擬,具體操作方法如下:

    1.3.5.1 α-葡萄糖苷酶空間立體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備 從蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫PDB下載α-葡萄糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)文件(PDB ID:2f6d,resolution:1.6 ,其中有配體抑制劑阿卡波糖),在Linux系統(tǒng)下使用Pymol軟件(version:1.7.2.1)去除其中的溶劑分子、磷酸根離子和鈉離子,再提取原配體阿卡波糖分子(ACR),確定結(jié)合位點,然后以Autodock Tools將其轉(zhuǎn)化為pdbqt格式,以此格式進(jìn)行后續(xù)分子對接。

    1.3.5.2 配體小分子的結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備 從PubChem數(shù)據(jù)中下載柯里拉京(CAS:23094-69-1)3D結(jié)構(gòu)文件,采用MM2力場進(jìn)行能量最小化,以Autodock Tools程序添加Gasteiger電荷,合并非極性氫原子后,將其轉(zhuǎn)化成pdbqt格式,作為對接配體的初始結(jié)構(gòu)。

    1.3.5.3 分子對接 采用Autodock Tools-grids,根據(jù)原有的配體阿卡波糖的坐標(biāo)文件將Grid Box的中心坐標(biāo)設(shè)置為(11.851,11.479,-6.564),格點盒子大小設(shè)置為40×46×40,格點間距設(shè)置為0.375 ,即空間大小為15 ×17.25 ×15 。使用Autodock vina軟件,采用Lamarckian遺傳算法(局部能量搜索與遺傳算法相結(jié)合)進(jìn)行對接,通過分子對接確定兩者的結(jié)合位置,獲得受體蛋白與配體小分子的結(jié)合自由能,分析配體與受體之間氫鍵結(jié)合的位置和數(shù)量以及酶蛋白與配體之間的疏水相互作用。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PNP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

    本研究繪制了PNP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性回歸方程為y=50.696x,其決定系數(shù)(r2)為0.999 8。

    2.2 柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制效果

    本研究檢測了5.0~80.0 μmol/L柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果,結(jié)果如圖1所示。隨著柯里拉京濃度的升高,抑制率不斷升高,當(dāng)濃度為80.0 μmol/L時,抑制率達(dá)到了59.38%。經(jīng)Graphpad prism 5.0軟件計算,本研究所采用的檢測條件下柯里拉京的半抑制濃度IC50為 15.33 μmol/L,低于阿卡波糖的半抑制劑濃度79.88 μmol/L。由此可知,柯里拉京對α-葡萄糖苷酶有很強的抑制效果,在降糖功能食品和藥物的開發(fā)方面具有很好的前景。

    2.3 柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)

    采用Origin 8.4軟件對柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)進(jìn)行了非線性擬合,擬合結(jié)果如圖2所示,所得表觀vmax、表觀Km如表1所示。方差分析結(jié)果表明,與空白模型(無抑制劑作用下)相比,在柯里拉京作用下,反應(yīng)體系的表觀Km顯著提高,而表觀vmax極顯著下降,柯里拉京表現(xiàn)出了顯著的混合抑制作用特點[10],因此確定柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為混合型抑制。

    根據(jù)酶促反應(yīng)理論,混合型抑制動力學(xué)的方程為

    v=vmax[S]Km1+[I]Ki+[S]1+[I]Ki。

    式中:[S]為底物濃度;[I]為抑制劑濃度。

    對該方程進(jìn)行雙倒數(shù)變換,再分別以變換后線性方程的斜率和截距對抑制劑濃度[I]作圖,據(jù)此計算出了柯里拉京的抑制常數(shù)Ki和Ki′,分別為37.37 μmol/L和76.3 μmol/L。

    2.4 柯里拉京與α-葡萄糖苷酶分子對接

    柯里拉京與α-葡萄糖苷酶分子對接結(jié)果如圖3和圖4所示。通過對接分析,發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶與柯里拉京分子之間4 以內(nèi)的相互作用的的氨基酸有21個(圖4),具體如下:PRO-61、ASP-62、TYR-63、TRP-67、LYS-127、TYR-135、ALA-138、TRP-139、GLY-140、PHE-206、TRP-209、GLU-210、GLU-211、ARG-345、TYR-351、GLY-353、ASP-354、GLY-355、SER-356、TRP-362、GLU-456。從空間對接模型圖(圖3、圖4)可知,在酶的活性腔中,柯里拉京分子的非極性基團被極性基團包裹,其分子上的羥基與酶蛋白的氨基酸殘基之間形成了12個氫鍵,具體如下:與ARG-345殘基形成了2個氫鍵,與TRP-209殘基形成了1個氫鍵,與GLU-210殘基形成了1個氫鍵,與GLU-211殘基形成了1個氫鍵,與SER-356殘基形成了1個氫鍵,與TYR-63殘基形成了2個氫鍵,與TYR-351殘基形成了4個氫鍵。Autodock vina軟件計算結(jié)果顯示,兩者之間的結(jié)合自由能為-33.91 kJ/mol。以上分析結(jié)果表明,氫鍵是柯里拉京與α-葡萄糖苷酶之間相互結(jié)合的主要作用力, 柯里拉京可以很好地結(jié)合于酶的活性口袋之中,結(jié)合自由能較低,模型較好地解釋了柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的高抑制活性。

    3 結(jié)論

    柯里拉京是藏藥余甘子抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性成分,半抑制濃度IC50為15.33 μmol/L,抑制效果遠(yuǎn)高于陽性對照藥物阿卡波糖,非線性擬合分析表明,其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為混合型抑制;分子對接發(fā)現(xiàn)氫鍵是柯里拉京與α-葡萄糖苷酶主要的相互作用力,后續(xù)將采用糖尿病動物模型進(jìn)一步研究藏藥余甘子及其柯里拉京成分的降血糖作用,可以進(jìn)一步開發(fā)為降糖保健品或藥品。

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