余甘子主要活性成分柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

瞿運秋 趙文佳 陳繼光

摘要：前期從余甘子中分離鑒定了一系列對α-葡萄糖苷酶有較好抑制活性的沒食子單寧成分，柯里拉京為其中的1個主要活性成分，本試驗進(jìn)一步對柯里拉京抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用機制進(jìn)行了研究。采用體外微量96孔板α-葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)模型測定了柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并進(jìn)行了抑制動力學(xué)試驗，以非線性擬合法分析了其對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)參數(shù)，同時采用分子對接模型研究了柯里拉京與α-葡萄糖苷酶相互作用的機制。結(jié)果表明，柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50為15.33 μmol/L，顯著低于陽性對照阿卡波糖的IC50（79.88 μmol/L）;非線性擬合結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為混合型抑制;氫鍵是柯里拉京與α-葡萄糖苷酶之間相互結(jié)合的主要作用力。結(jié)果為柯里拉京作為降糖保健品或藥品開發(fā)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：余甘子;柯里拉京;α-葡萄糖苷酶;酶動力學(xué);酶抑制;分子對接

中圖分類號： R285.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0206-03

以胰島素抵抗為特征的Ⅱ型糖尿病占糖尿病發(fā)病總數(shù)90%以上，我國Ⅱ型糖尿病的患病人數(shù)占總?cè)丝?0%左右，成為全球糖尿病患病人數(shù)第二大國[1]。糖尿病主要對眼睛、腎臟、神經(jīng)心血管、下肢血管等造成損害并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致多器官功能衰竭，因此針對糖尿病的治療主要以控制血糖水平，預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生為主。以阿卡波糖為代表的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有很好地控制餐后血糖水平的功效，是臨床常用的治療糖尿病藥物。

α-葡萄糖苷酶是存在于小腸絨毛膜上的一組酶系，能夠催化食物中淀粉、蔗糖和麥芽糖等多糖、寡糖和二糖水解為可吸收的單糖（葡萄糖和果糖）。α-葡萄糖苷酶的抑制劑通過競爭抑制α-葡萄糖苷酶活性，延緩多糖、寡糖和二糖向單糖的轉(zhuǎn)化，控制餐后血糖濃度[2]。最近幾年，以α-葡萄糖苷酶為作用靶點，從藥用、可食性植物或微生物中篩選活性成分是研究熱點[3-6]。對α-葡萄糖苷酶有抑制作用的植物活性成分主要包括萜類、生物堿、醌類、黃酮、多酚、苯丙烷和類固醇化合物等[7]。多酚類化合物可以通過多途徑抑制α-葡萄糖苷酶活性，金銀花花蕾中3，5-二咖啡?？鼘幩嵬ㄟ^非競爭性抑制小腸α-葡萄糖苷酶活性[8];然而，劉雪輝等對從紫甘薯莖葉中分離的4個高純度咖啡?；鼘幩犷愃莆铮ňG原酸、4，5-O-咖啡?；鼘幩帷?，5-O-咖啡?；鼘幩峒?，4-O-咖啡?；鼘幩幔┮种痞?葡萄糖苷酶活性機制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，這些物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭性抑制[9]。因此對同一個化合物抑制α-葡萄糖苷酶機制進(jìn)行研究，不同的學(xué)者會得出不同的結(jié)論，筆者所在課題組前期通過5種方法對阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)地分析，結(jié)果表明，非線性擬合法更加簡便、合理及可靠，可以是研究酶促動力學(xué)的首選方法[10]。

余甘子為大戟科葉下珠屬植物的干燥成熟果實，有機酸類物質(zhì)是其主要成分，前期從余甘子降血糖活性部位分離鑒定出7個酚類活性成分，均具有很好的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用[11]，尤其是沒食子酸和柯里拉京活性最強?？吕锢┦且环N逆沒食子酸鞣質(zhì)，主要存在于龍眼核、余甘子、葉下珠全草、龍眼殼、欖仁樹葉和纖梗葉下珠全草等植物中[12]，具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗血栓、抑制病毒、抗菌、抗炎、降血壓等藥理作用，具有很大的藥用前景[13]。《中華人民共和國藥典》（2015版）規(guī)定沒食子酸為評價余甘子質(zhì)量的指標(biāo)成分，目前有較多學(xué)者報道增加多酚類成分柯里拉京為余甘子的另一個質(zhì)控指標(biāo)。

為了進(jìn)一步探討柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用機制，本研究采用非線性擬合法對其抑制α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用分子對接技術(shù)，初步探討其作用α-葡萄糖苷酶的主要作用位點，以期確定其抑制 α- 葡萄糖苷酶的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-葡萄糖苷酶，購自美國Sigma公司;4-硝基苯基-α-D- 吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG），購自美國Sigma公司;阿卡波糖（Acarbose），購自廣東省廣州市億邦醫(yī)藥科技有限公司;對硝基苯酚（PNP），購自上海展云化工有限公司;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀（國產(chǎn)分析純），購自西隴化工股份有限公司;甘油（國產(chǎn)分析純），購自上海瑞楚生物科技有限公司;實驗用水均為超純水。

1.2 主要儀器

SpectraMax M2型酶標(biāo)儀，美國分子儀器有限公司（Molecular Devices）;HH60型數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱，江蘇南京溫諾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑的配制 PBS（磷酸鹽緩沖液）：稱取4.559 g KH2PO4和7.646 g K2HPO4·3H2O，以去離子水定容至 500 mL，調(diào)節(jié)pH值至6.8，121 ℃滅菌20 min，4 ℃貯存?zhèn)溆?α-葡萄糖苷酶：將α-葡萄糖苷酶凍干粉溶于含50%甘油的磷酸鹽緩沖液（pH值6.8），配制成100 U/mL的酶溶液，分裝，-20 ℃凍存?zhèn)溆?PNPG、PNP、阿卡波糖均以磷酸緩沖液配制，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 PNP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取不同體積的PNP標(biāo)準(zhǔn)品溶液于96孔板中，以PBS補足至200 μL，配成0、0.03、0.06、0.15、0.30、0.60、1.50、3.00、6.00、12.00、24.00、48.00、96.00 nmol的系列PNP標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于405 nm處測定吸光度，重復(fù)測定4次。以吸光度（D）為橫坐標(biāo)，PNP的物質(zhì)的量為縱坐標(biāo)，繪制測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定方法 以微量的96孔板α-葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)體系為模型進(jìn)行檢測，具體操作如下：依次往各反應(yīng)孔中加入PBS、α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）5 μL、待測抑制劑樣品10 μL，混勻后置于37 ℃水浴中孵育20 min;加入16 μL的PNPG（2.5 mmol/L），置于 37 ℃ 水浴中反應(yīng)6 min，于405 nm波長下測定吸光度，重復(fù)檢測3次，每次設(shè)4個平行處理。以阿卡波糖為陽性對照物，濃度設(shè)為1.0 mmol/L;待測抑制劑設(shè)5、10、20、40、80 μmol/L 5個濃度梯度。

酶活抑制率=（D空白-D樣品）/D空白×100%。

式中：D空白為未加抑制劑組的吸光度;D樣品為待測抑制劑組的吸光度。采用Graphpad prism 5.0軟件處理試驗數(shù)據(jù)，計算待測抑制劑的半抑制濃度（IC50）。

1.3.4 抑制劑抑制動力學(xué)檢測方法 基于微量的96孔板 α- 葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，具體操作如下：依次往各反應(yīng)孔中加入PBS、α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）5 μL和待測抑制劑溶液10 μL（以阿卡波糖陽性對照物），混勻后置于37 ℃水浴中孵育20 min;每孔分別加入0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500、0.600、0.800、1.000 mmol/L 的PNPG，于 37 ℃ 水浴中反應(yīng)6 min，405 nm波長下測定吸光度，計算反應(yīng)速度，重復(fù)檢測3次。采用Origin 8.4軟件，以底物濃度（S）為自變量、反應(yīng)速度（v）為因變量進(jìn)行非線性擬合，計算抑制劑作用下反應(yīng)體系的表觀vmax和表觀Km，并通過方差分析來判斷vmax和Km的差異顯著性，據(jù)此確定待測抑制劑的抑制作用類型。

1.3.5 酶與抑制劑分子對接方法 參照王雪潔等的方法[14]進(jìn)行分子對接模擬，具體操作方法如下：

1.3.5.1 α-葡萄糖苷酶空間立體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備 從蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫PDB下載α-葡萄糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)文件（PDB ID：2f6d，resolution：1.6 ，其中有配體抑制劑阿卡波糖），在Linux系統(tǒng)下使用Pymol軟件（version：1.7.2.1）去除其中的溶劑分子、磷酸根離子和鈉離子，再提取原配體阿卡波糖分子（ACR），確定結(jié)合位點，然后以Autodock Tools將其轉(zhuǎn)化為pdbqt格式，以此格式進(jìn)行后續(xù)分子對接。

1.3.5.2 配體小分子的結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備 從PubChem數(shù)據(jù)中下載柯里拉京（CAS：23094-69-1）3D結(jié)構(gòu)文件，采用MM2力場進(jìn)行能量最小化，以Autodock Tools程序添加Gasteiger電荷，合并非極性氫原子后，將其轉(zhuǎn)化成pdbqt格式，作為對接配體的初始結(jié)構(gòu)。

1.3.5.3 分子對接 采用Autodock Tools-grids，根據(jù)原有的配體阿卡波糖的坐標(biāo)文件將Grid Box的中心坐標(biāo)設(shè)置為（11.851，11.479，-6.564），格點盒子大小設(shè)置為40×46×40，格點間距設(shè)置為0.375 ，即空間大小為15 ×17.25 ×15 。使用Autodock vina軟件，采用Lamarckian遺傳算法（局部能量搜索與遺傳算法相結(jié)合）進(jìn)行對接，通過分子對接確定兩者的結(jié)合位置，獲得受體蛋白與配體小分子的結(jié)合自由能，分析配體與受體之間氫鍵結(jié)合的位置和數(shù)量以及酶蛋白與配體之間的疏水相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 PNP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

本研究繪制了PNP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性回歸方程為y=50.696x，其決定系數(shù)（r2）為0.999 8。

2.2 柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制效果

本研究檢測了5.0～80.0 μmol/L柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果，結(jié)果如圖1所示。隨著柯里拉京濃度的升高，抑制率不斷升高，當(dāng)濃度為80.0 μmol/L時，抑制率達(dá)到了59.38%。經(jīng)Graphpad prism 5.0軟件計算，本研究所采用的檢測條件下柯里拉京的半抑制濃度IC50為 15.33 μmol/L，低于阿卡波糖的半抑制劑濃度79.88 μmol/L。由此可知，柯里拉京對α-葡萄糖苷酶有很強的抑制效果，在降糖功能食品和藥物的開發(fā)方面具有很好的前景。

2.3 柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)

采用Origin 8.4軟件對柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)進(jìn)行了非線性擬合，擬合結(jié)果如圖2所示，所得表觀vmax、表觀Km如表1所示。方差分析結(jié)果表明，與空白模型（無抑制劑作用下）相比，在柯里拉京作用下，反應(yīng)體系的表觀Km顯著提高，而表觀vmax極顯著下降，柯里拉京表現(xiàn)出了顯著的混合抑制作用特點[10]，因此確定柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為混合型抑制。

根據(jù)酶促反應(yīng)理論，混合型抑制動力學(xué)的方程為

v=vmax[S]Km1+[I]Ki+[S]1+[I]Ki。

式中：[S]為底物濃度;[I]為抑制劑濃度。

對該方程進(jìn)行雙倒數(shù)變換，再分別以變換后線性方程的斜率和截距對抑制劑濃度[I]作圖，據(jù)此計算出了柯里拉京的抑制常數(shù)Ki和Ki′，分別為37.37 μmol/L和76.3 μmol/L。

2.4 柯里拉京與α-葡萄糖苷酶分子對接

柯里拉京與α-葡萄糖苷酶分子對接結(jié)果如圖3和圖4所示。通過對接分析，發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶與柯里拉京分子之間4 以內(nèi)的相互作用的的氨基酸有21個（圖4），具體如下：PRO-61、ASP-62、TYR-63、TRP-67、LYS-127、TYR-135、ALA-138、TRP-139、GLY-140、PHE-206、TRP-209、GLU-210、GLU-211、ARG-345、TYR-351、GLY-353、ASP-354、GLY-355、SER-356、TRP-362、GLU-456。從空間對接模型圖（圖3、圖4）可知，在酶的活性腔中，柯里拉京分子的非極性基團被極性基團包裹，其分子上的羥基與酶蛋白的氨基酸殘基之間形成了12個氫鍵，具體如下：與ARG-345殘基形成了2個氫鍵，與TRP-209殘基形成了1個氫鍵，與GLU-210殘基形成了1個氫鍵，與GLU-211殘基形成了1個氫鍵，與SER-356殘基形成了1個氫鍵，與TYR-63殘基形成了2個氫鍵，與TYR-351殘基形成了4個氫鍵。Autodock vina軟件計算結(jié)果顯示，兩者之間的結(jié)合自由能為-33.91 kJ/mol。以上分析結(jié)果表明，氫鍵是柯里拉京與α-葡萄糖苷酶之間相互結(jié)合的主要作用力， 柯里拉京可以很好地結(jié)合于酶的活性口袋之中，結(jié)合自由能較低，模型較好地解釋了柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的高抑制活性。

3 結(jié)論

柯里拉京是藏藥余甘子抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性成分，半抑制濃度IC50為15.33 μmol/L，抑制效果遠(yuǎn)高于陽性對照藥物阿卡波糖，非線性擬合分析表明，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為混合型抑制;分子對接發(fā)現(xiàn)氫鍵是柯里拉京與α-葡萄糖苷酶主要的相互作用力，后續(xù)將采用糖尿病動物模型進(jìn)一步研究藏藥余甘子及其柯里拉京成分的降血糖作用，可以進(jìn)一步開發(fā)為降糖保健品或藥品。

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