茶樹紫色芽葉花色苷富集特性研究

劉林峰 林玲 周陽

摘要：以紅芽佛手、自選9803、安73等3個紫芽茶樹品種（系）的1芽3葉茶梢為研究對象，采用紫外-可見光譜和高效液相色譜技術(shù)，分析研究不同品種（系）、不同部位、不同生長季節(jié)茶樹紫色芽葉花色苷的富集特性，以期為茶樹紫色芽葉及其花色苷的高值化利用提供參考。結(jié)果表明，不同品種（系）、不同部位、不同生長季節(jié)茶樹對花色苷的富集能力存在顯著差異;不同茶樹品種（系）富集能力由強到弱依次為自選9803>安73>紅芽佛手，不同部位富集能力由強到弱依次為第1>第2>芽頭>第3，同時3個茶樹品種（系）隨春末、夏初、夏中、夏末、秋初、秋中的季節(jié)變化對花色苷的富集呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，自選9803葉片在夏末花色苷含量達到最高值（14.24 mg/g），安73在夏末達到最大值（12.63 mg/g），紅芽佛手則在夏初達到最高值（7.33 mg/g）。

關(guān)鍵詞：茶葉;紫芽;花色苷;富集特性

中圖分類號：S571.101 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0169-03

茶樹紫色芽葉是由茶葉花色苷引起的，花色苷屬多酚類物質(zhì)，多以糖苷形式存在[1]，易溶于水和乙醇、甲醇等醇類化合物，不溶于乙醚、氯仿等有機溶劑，在酸性條件下穩(wěn)定，其顏色隨pH值的變化而變化[2]。研究證實，花色苷具有抗氧化、清除自由基、護肝解毒等[3-7]多種生物活性，被廣泛用于食品、飲料、醫(yī)藥、化工、紡織等[8]領(lǐng)域，是近年茶樹種質(zhì)資源及功能成分利用的研究熱點。云南省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所選育了高花色苷茶樹品種紫娟;劉富知等發(fā)現(xiàn)，4.35%的安化群體茶樹品種具有高花色苷特征[9];蕭力爭等比較了5個特定紫芽茶樹品種春梢芽葉中花色苷含量的差異[10];李燕麗等檢測了不同季節(jié)紫娟茶花色苷相對含量[11];Lai等分析了紫芽茶樹品種紫娟花色苷的累積情況[12]。然而，鮮見對花色苷及組分在不同品種（系）、不同部位、不同生長季節(jié)茶樹中富集特性的系統(tǒng)研究。本研究以紅芽佛手、自選9803、安73等3個紫芽茶樹品種（系）的1芽3葉茶梢為對象，采用紫外-可見光譜和高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，分析不同品種（系）、不同部位、不同生長季節(jié)茶樹紫色芽葉花色苷及其組分的富集特性，以期為茶樹紫色芽葉及其花色苷的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從2016年4月中下旬開始至2016年9月中旬每15 d采摘1次湖南農(nóng)業(yè)大學長安教學實踐基地茶園中易紫芽化自選9803、紅芽佛手和安73等3個茶樹品種（系）的1芽3葉，并將其芽頭、第1葉、第2葉和第3葉分開收集，冷凍干燥后制成干粉，塑料袋密封后保存于冰箱中，備用。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

試劑：乙腈、甲醇（分析純）、甲醇（色譜純）、無水乙醇（分析純）均購于天津市恒興化學試劑制造有限公司;標準品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷購于北京譜析科技有限公司;飛燕草素-葡萄糖苷購于西寶生物科技（上海）股份有限公司;超純水自制;酸性乙醇水溶液（85 mL 無水乙醇加15 mL 1%鹽酸水）自配。

儀品設(shè)備：C18 ECOSIL HPLC COLUMN色譜分析柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm，日本ECOSIL公司）、UV754N紫外可見分光光度計（德國Thermo Scientific公司），高效液相色譜儀A20（日本島津公司），精密電子天平（瑞士Starorius公司），pH計（瑞士梅特勒-托利多公司），超低溫冰箱（美國Thermo公司），DSY-2-8水浴鍋（北京國華醫(yī)療器械廠）。

1.3 方法

1.3.1 花色苷提取 參照文獻和預(yù)試驗結(jié)果，采用回流提取方法提取茶葉干粉中的花色苷，提取條件為80%乙醇（添加1%冰乙酸水溶液）、1 g ∶ 50 mL料液比，80 ℃下回流提取 60 min，過濾取濾液[13-15]。

1.3.2 紫外-可見光譜檢測花色苷總量 參照報道文獻，采用單一pH法，吸取4 mL樣品提取濾液用酸性乙醇水溶液定容至10 mL以酸性乙醇水溶液為空白對照，顯色30 min，在 535 nm 波長下測定吸光度，重復(fù)3次[16-17]，根據(jù)以下公式[18]計算花色苷總量：

花色苷總量=[（D試液-D對照液）×101.83]/[吸取溶液量/樣品干質(zhì)量][19]。

式中：101.83為摩爾消光系數(shù)。

1.3.3 HPLC外標法檢測茶葉花色苷組分 色譜柱為C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm），柱溫30 ℃，檢測波長 520 nm，流動相為0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～60 min，10%～40% B），流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL，系統(tǒng)平衡 10 min 后再次進樣。

1.3.4 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 22.0進行方差分析，各處理組間采用最小顯著差數(shù)法（LSD法）比較，P<0.05時表示具有統(tǒng)計學顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶樹品種（系）花色苷富集差異比較

圖1顯示，不同茶樹品種（系）所富集的花色苷總量存在顯著差異（P安73（8.11 mg/g）>紅芽佛手（4.98 mg/g）;同時，3個品種（系）樣品和3種標準品混合標樣的HPLC圖譜相比，茶樹紫色芽葉中的花色苷組分與其他常見植物中的花色苷組分并不相同，組分1～7為3個品種（系）所共有（圖2），表示這7個組分可作為茶樹紫色芽葉中的特征花色苷組分，且以組分5和組分6含量較高，但其分子結(jié)構(gòu)有待進一步探究;也進一步說明在外界環(huán)境差異不大的情況下，茶樹對花色苷的富集主要取決于品種（系）的遺傳因素。

表1表明，同一生長季節(jié)，不同茶樹品種（系）的花色苷總量存在顯著差異。自選9803花色苷富集能力最強，在各生長季節(jié)與紅芽佛手均存在顯著性差異（P<0.05）;安73富集能力次之，在春秋（除秋初外）2季富集明顯不如9803（P<0.05），在夏中和夏末則明顯強于紅芽佛手（P<0.05），說明茶樹對花色苷的富集也受生長季節(jié)等環(huán)境因素的影響。

圖3表明，芽頭部分自選9803的花色苷總量顯著高于安73和紅芽佛手（P<0.05），第1葉部分第3個品種（系）之間差異顯著（P<0.05），第2葉部分紅芽佛手富集能力顯著低于其他2個品種（P<0.05），第3葉部分3個品種（系）含量差異不顯著;由此提示，不同茶樹品種（系）對花色苷的富集還與芽葉分化成熟度有關(guān)。

2.2 不同部位花色苷富集差異比較

圖4顯示，茶樹紫色芽葉花色苷在第1中富集最多，在第3葉中富集最少，并與其他部位有顯著性差異（P第2葉（7.44 mg/g）>芽頭（6.91 mg/g）>第3葉（4.46 mg/g），猜測茶樹對花色苷的富集可能與葉片基因的表達受葉片成熟度的影響有關(guān)。

由表2可知，同一生長季節(jié)不同茶樹芽葉部位對花色苷的富集能力存在顯著差異，其中第1葉富集能力最強，在各生長季節(jié)與其他部位均存在顯著差異（P<0.05）;各部位的花色苷總量均隨生長季節(jié)的變化而表現(xiàn)先升后降趨勢，其中，第1、2中的花色苷總量隨季節(jié)變化相對明顯，而芽頭和第3葉花色苷總量隨季節(jié)變化不明顯，表明茶樹不同芽葉部位隨生長季節(jié)變化而對花色苷的富集差異主要體現(xiàn)在第1、2葉的差異上。

2.3 不同生長季節(jié)花色苷富集差異比較

圖5表明，茶樹在不同生長季節(jié)對花色苷富集特性呈現(xiàn)出由春季到夏季緩慢升高，夏末后逐漸降低的變化趨勢，說明光照、溫度等環(huán)境因素的變化對茶樹富集花色苷影響較大，這可能是由于光照度、光質(zhì)、氣溫、濕度等影響了茶樹花色苷代謝途徑中相關(guān)酶基因的表達，從而使得茶樹在夏季對花色苷的富集作用增強。

3 討論

茶葉花色苷是花青素與糖苷的結(jié)合物，其中花青素是由查爾酮合成的，具有多種生物活性，研究茶樹對花色苷的富集特性對選育高花色苷茶樹品種、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培茶樹以及開發(fā)利用茶葉花色苷具有重要的理論與實踐意義[19]。資料表明，植物葉片在不同的發(fā)育期對逆境脅迫敏感度不同，且不同葉片花色苷關(guān)鍵代謝酶的表達量和累積量不同[20-21];在茶樹花青素合成途徑中部分關(guān)鍵酶基因在嫩葉中的表達水平明顯高于老葉[22]。本研究發(fā)現(xiàn)不同品種（系）、不同部位、不同生長季節(jié)茶樹中的花色苷總量存在顯著差異，與前人研究結(jié)果[21-24]相符。3個茶樹品種（系）對花色苷的富集能力由強到弱依次為自選9803>安73>紅芽佛手，不同部位富集能力由強到弱依次為第1葉>第2葉>芽頭>第3葉，同時隨著由春末至秋中的季節(jié)變化，茶樹對花色苷的富集總體上呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，其中，自選9803葉片在夏末花青素含量達到最高值（14.24 mg/g），安73在夏末達到最大值（12.63 mg/g），紅芽佛手則在夏初達到最高值（7.33 mg/g），與前人對光照等環(huán)境因子調(diào)控茶樹紫色芽葉的研究結(jié)果[23-24]相一致，說明茶樹紫色芽葉對花色苷的富集同時受到茶樹種質(zhì)、生長環(huán)境、分化發(fā)育程度等多種因素的調(diào)控。芽頭的嫩度最好，但花色苷富集能力卻較第1葉弱的原因，有必要后期從茶樹芽葉不同部位中花色苷代謝途徑關(guān)鍵酶基因?qū)用骈_展深入研究。另一方面，本研究通過HPLC檢測到的7個茶樹紫芽花色苷組分尚未作分離鑒定，后續(xù)研究可通過應(yīng)用最新分離純化技術(shù)獲得花色苷組分單體，以便進一步探究茶樹紫色芽葉花色苷的化學密碼。

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