細(xì)胞自噬在擬南芥應(yīng)答鎘脅迫中的作用

管彬 周竹青

摘要：以擬南芥野生型（WT）、呼吸暴發(fā)氧化酶f（rbohf）突變體、細(xì)胞自噬2（atg2）突變體、atg5突變體和轉(zhuǎn)基因GFP-ATG8a為材料，利用遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)手段分析細(xì)胞自噬在應(yīng)答鎘脅迫中的作用。結(jié)果表明，鎘脅迫可以誘導(dǎo)野生型擬南芥根中活性氧（ROS）的積累;鎘脅迫誘導(dǎo)野生型擬南芥中自噬相關(guān)基因ATG2、ATG5、ATG7和ATG8a的表達(dá)以及自噬體的積累。進(jìn)一步研究表明，在鎘脅迫處理后，atg突變體中自噬體的數(shù)量與野生型相比明顯降低，ROS水平卻顯著升高。上述結(jié)果初步表明，細(xì)胞自噬通過(guò)調(diào)節(jié)ROS應(yīng)答鎘脅迫。研究結(jié)果為深入研究植物應(yīng)答鎘脅迫的分子機(jī)制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：擬南芥;細(xì)胞自噬;鎘脅迫;活性氧

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945.78 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0090-06

鎘（Cd）是土壤重金屬污染的主要元素之一[1]，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育危害較大。在鎘脅迫發(fā)生時(shí)，首先影響植物根系，使線(xiàn)粒體、葉綠體等細(xì)胞器發(fā)生損傷，造成活性氧（ROS）的大量積累，產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致積累損傷蛋白質(zhì)[2]。ROS是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類(lèi)活性含氧化合物的總稱(chēng)，主要包括超氧陰離子自由基（ O-2 · ?）、羥自由基（·OH）、過(guò)氧化氫（H2O2）和單線(xiàn)態(tài)氧（1O2）等[3]。在正常情況下，植物細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，不會(huì)造成傷害。但是，環(huán)境脅迫能打破植物細(xì)胞內(nèi)ROS的代謝平衡，導(dǎo)致ROS積累。在擬南芥中，ROS的一個(gè)重要來(lái)源是植物呼吸暴發(fā)氧化酶（RBOH），存在10個(gè)RBOH基因，分別是AtRBOHA～AtRBOHJ[4]。在鎘脅迫下，AtRBOHC、AtRBOHD、AtRBOHF基因調(diào)節(jié)ROS的代謝[5]。

細(xì)胞自噬是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中、利用液泡或溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)損傷細(xì)胞器和蛋白的過(guò)程[6-8]。植物細(xì)胞自噬主要分為兩類(lèi)：微自噬和巨自噬（下文涉及的細(xì)胞自噬為巨自噬）[9]。微自噬是指液泡膜內(nèi)陷將底物包裹并降解的過(guò)程[10]。巨自噬是細(xì)胞接受信號(hào)誘導(dǎo)后，在胞內(nèi)產(chǎn)生新月?tīng)罨蛘弑瓲畹淖允膳?，包裹需要降解的?xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，形成自噬體并運(yùn)往液泡降解[11]。目前人們已經(jīng)在酵母中發(fā)現(xiàn)了32個(gè)參與細(xì)胞自噬過(guò)程的基因（ATG），在模式植物擬南芥中，也有超過(guò)30個(gè)ATG被發(fā)現(xiàn)[12]。在自噬體的形成中，有ATG8-PE連接體系和ATG5-12-16連接體系[13]。ATG8-PE連接體系主要負(fù)責(zé)ATG8與磷脂酰乙醇胺（PE）的類(lèi)泛素化連接并定位在吞噬體膜上[14]。ATG8-PE從吞噬體膜的起始到被液泡降解，伴隨了整個(gè)細(xì)胞自噬的發(fā)生過(guò)程，因此ATG8被廣泛用作自噬檢測(cè)的標(biāo)記蛋白[15]，而ATG5-12-16連接系統(tǒng)有促進(jìn)ATG8-PE形成的功能[16]。

鎘脅迫可以產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致ROS和損傷蛋白質(zhì)的積累[17]。在植物中，ROS可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生而減少氧化損傷[18]。對(duì)野生型擬南芥外源施加ROS的誘導(dǎo)劑甲基紫腈（MV），可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。而用MV處理atg10b突變體后，引起氧化蛋白的大量積累，使其對(duì)氧化脅迫更為敏感[19-20]。另外有研究表明，擬南芥atg突變體中的ROS水平明顯較野生型中的ROS水平高[21]。ROS作為信號(hào)分子可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，從而減少ROS和損傷蛋白質(zhì)對(duì)植物細(xì)胞的傷害。因此，有理由相信細(xì)胞自噬在鎘脅迫中有重要作用。目前，細(xì)胞自噬在鎘脅迫中的作用仍不清楚。本研究旨在通過(guò)遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)手段來(lái)研究細(xì)胞自噬應(yīng)答鎘脅迫的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥和atg2、atg5和rbohf突變體種子由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，轉(zhuǎn)基因GFP-ATG8a種子由華南師范大學(xué)陳文利教授惠贈(zèng)。所有種子均經(jīng)1%次氯酸鈉溶液表面消毒 12 min 后，用無(wú)菌水沖洗4～5遍，置于4 ℃冰箱3 d，然后點(diǎn)種在1/2 MS培養(yǎng)基上，垂直斜放在光—暗周期為16 h—8 h、光照度為120 μmol/（L·m2·s）、溫度為22 ℃、相對(duì)濕度為60%的培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2 鎘脅迫處理

本試驗(yàn)于2017年在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選擇在人工氣候培養(yǎng)箱中正常生長(zhǎng) 5 d 左右的擬南芥，分別轉(zhuǎn)移至氯化鎘濃度為0、25、50 μmol/L 的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行鎘脅迫處理。轉(zhuǎn)移好后用封口膜封口，于22 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)處理2 d，測(cè)量擬南芥野生型和突變體的根長(zhǎng)（n=20），設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，記錄數(shù)據(jù)。

1.3 自噬體觀(guān)察

將用GFP（綠色熒光蛋白）-ATG8e標(biāo)記的擬南芥植株放于載玻片上，小心夾取，擺放端正，滴1滴蒸餾水于載玻片上，緩慢向下壓片，使細(xì)胞分布相對(duì)均勻。使用徠卡倒置共聚焦顯微鏡（Leica SP8）的40×或20×水鏡或光鏡觀(guān)察擬南芥根的GFP熒光信號(hào)。GFP的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為507 nm。

單丹磺酰尸胺（MDC）染色：將擬南芥完全浸入 50 μmol/L MDC染液（Sigma-Aldrich）中，于37 ℃染色 10 min，然后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次。使用激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8）的40×水鏡加上4′，6-二脒基-2- 苯基吲哚（DAPI）濾鏡觀(guān)察擬南芥根的MDC激發(fā)的熒光信號(hào)。MDC的激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。

1.4 活性氧的檢測(cè)

用特異性ROS熒光探針2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）觀(guān)察內(nèi)源性ROS的水平。將擬南芥完全浸入10 μmol/L DCFH-DA染液（Sigma-Aldrich）中，于37 ℃染色處理30 min，然后用PBS沖洗3次。使用倒置激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8）的20×干鏡觀(guān)察擬南芥根的DCFH-DA激發(fā)的熒光信號(hào)。DCFH-DA的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為605 nm。主要在相同參數(shù)設(shè)置下和相同gain值（用來(lái)表示熒光強(qiáng)度）下拍照。用Image pro plus 6.0測(cè)量其相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.5 RT-PCR分析

將新鮮的擬南芥組織用液氮研磨成粉末，用TRIzol抽提總RNA，最后將總RNA溶于焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，簡(jiǎn)稱(chēng)DEPC）水中。用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒將分離的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用TaKaRa公司的SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每組試驗(yàn)設(shè)3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)程序如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果用2-ΔΔCT進(jìn)行分析，以ACTIN2基因作為內(nèi)參基因，熒光定量PCR反應(yīng)的引物序列見(jiàn)表1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

除了特別說(shuō)明，所有試驗(yàn)都重復(fù)3次及以上，本研究結(jié)果都以“x±s”表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 7.0軟件的雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫誘導(dǎo)活性氧的積累

為了研究ROS是否參與鎘脅迫，筆者利用ROS特異性探針DCFH-DA檢測(cè)鎘脅迫處理后野生型擬南芥根中ROS的變化。DCFH-DA染色結(jié)果顯示，鎘脅迫處理后的ROS含量在擬南芥根中明顯升高（圖1-A）。對(duì)3組重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)用25、50 μmol/L CdCl2處理后的ROS含量分別是對(duì)照的1.33、2.37倍（圖1-B），這表明鎘脅迫誘導(dǎo)了ROS的產(chǎn)生。由于RBOHF基因參與了鎘脅迫下過(guò)氧化氫的產(chǎn)生，而過(guò)氧化氫是ROS的一種[5]。為了獲取ROS參與鎘脅迫的遺傳學(xué)證據(jù)，對(duì)野生型和rbohf突變體進(jìn)行鎘脅迫處理。表型分析結(jié)果表明，生長(zhǎng)在正常MS培養(yǎng)基上的野生型和rbohf突變體植株的表型沒(méi)有明顯差異;但是在添加 50 μmol/L CdCl2的MS培養(yǎng)基上處理2 d后，rbohf突變體的主根明顯比野生型的短（圖1-C）。根長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，用50 μmol/L CdCl2處理后，rbohf突變體的根長(zhǎng)比野生型的減少了38%（圖1-D），這表明rbohf突變體對(duì)鎘脅迫敏感。

2.2 鎘脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生

為了研究細(xì)胞自噬是否參與擬南芥的鎘脅迫，對(duì)CdCl2處理濃度分別為25、50 μmol/L的擬南芥進(jìn)行取樣，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a基因的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明，鎘脅迫處理后，細(xì)胞自噬相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平明顯上升（圖2）。用25 μmol/L CdCl2處理后，ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a基因的表達(dá)量分別是對(duì)照組的 2.04、3.40、2.81、5.82倍;用50 μmol/L CdCl2處理后，ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a基因的表達(dá)量分別是對(duì)照組的3.93、7.76、 4.19、 12.86倍。 這些結(jié)果表明， 鎘脅迫誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，利用轉(zhuǎn)基因 GFP-ATG8a 幼苗來(lái)觀(guān)察自噬體。將用25、50 μmol/L CdCl2處理和正常條件下生長(zhǎng)的植株直接放置在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。結(jié)果表明，鎘脅迫處理后的擬南芥根中有較多GFP-ATG8a標(biāo)記的點(diǎn)狀或環(huán)狀的自噬體積累，而在對(duì)照中較少（圖3-A）。對(duì)3組重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)用25、50 μmol/L CdCl2處理后的自噬體數(shù)分別是對(duì)照的8.89、13.32 倍（圖3-B）。

2.3 atg突變體對(duì)鎘脅迫敏感的表現(xiàn)

為了研究細(xì)胞自噬在鎘脅迫中的作用，用50 μmol/L CdCl2處理擬南芥野生型或細(xì)胞自噬突變體植株。結(jié)果表明，生長(zhǎng)在正常MS培養(yǎng)基上的野生型和atg突變體植株的表型沒(méi)有明顯差異;但是在添加50 μmol/L CdCl2的MS培養(yǎng)基上處理2 d后，atg突變體的主根明顯比野生型短（圖4-A）。這表明atg突變體對(duì)鎘脅迫敏感。根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，鎘脅迫處理后，atg2、atg5突變體的根長(zhǎng)分別比野生型減少了18%、28%（圖4-B）。為了進(jìn)一步研究細(xì)胞自噬在鎘脅迫中的功能，對(duì)用50 μmol/L CdCl2處理的擬南芥野生型或細(xì)胞自噬突變體植株進(jìn)行MDC染色。圖像分析結(jié)果表明，在正常MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，野生型和atg突變體中的自噬體較少。用鎘脅迫處理后，野生型植株中的點(diǎn)狀或環(huán)狀結(jié)構(gòu)自噬體數(shù)明顯增加，而atg突變體中的自噬體數(shù)沒(méi)有明顯變化（圖4-C）。3組重復(fù)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，用50 μmol/L CdCl2處理后，野生型擬南芥中的自噬體數(shù)是對(duì)照的10.5倍，而atg突變體的自噬體數(shù)沒(méi)有明顯變化（圖4-D）。上述結(jié)果表明，atg突變體對(duì)鎘脅迫敏感。

2.4 atg突變體在鎘脅迫下活性氧的積累

為了研究細(xì)胞自噬與ROS的關(guān)系，用DCFH-DA檢測(cè)50 μmol/L CdCl2處理后，野生型、atg2和atg5幼苗中的ROS水平變化。染色結(jié)果顯示，在正常MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，atg2、atg5突變體中的ROS含量與野生型沒(méi)有明顯差異。在遭受鎘脅迫處理后，野生型、atg2、atg5幼苗中的ROS含量明顯升高，atg2、atg5突變體中的ROS水平比野生型的高（圖5-A）。3組重復(fù)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，用50 μmol/L CdCl2處理后，atg2、atg5突變體中的ROS含量分別比野生型的高2.40、2.29倍（圖5-B），這說(shuō)明細(xì)胞自噬可以通過(guò)調(diào)控植物ROS的產(chǎn)生來(lái)應(yīng)答鎘脅迫。

3 結(jié)論與討論

鎘是一種重金屬污染物，可以影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[22-23]。當(dāng)鎘脅迫發(fā)生時(shí)，植物會(huì)發(fā)生一系列生理生化改變來(lái)抵抗鎘脅迫[2]。ROS作為一種重要的信號(hào)分子，參與應(yīng)答各種非生物脅迫。鎘脅迫使植物產(chǎn)生氧化損傷，促使ROS積累[17]。本研究結(jié)果表明，鎘脅迫處理后擬南芥根尖積累了大量的ROS。另外，由于RBOH是模式植物擬南芥ROS的最主要來(lái)源[5]，通過(guò)觀(guān)察rbohf突變體的表型發(fā)現(xiàn)，rbohf突變體對(duì)鎘脅迫敏感。這表明RBOHF可能參與鎘脅迫下ROS的產(chǎn)生。

細(xì)胞自噬在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)脅迫、氧化脅迫等脅迫中發(fā)揮著重要作用[24]。在植物中，細(xì)胞自噬能被非生物脅迫包括饑餓、氧化和滲透脅迫誘導(dǎo)[25]。同酵母一樣，煙草懸浮細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下也能夠激活細(xì)胞自噬。對(duì)其進(jìn)行饑餓處理會(huì)引起自噬相關(guān)基因ATG4a、ATG4b、ATG8a、ATG8i、ATG3、ATG7的表達(dá)水平升高[26]。本研究結(jié)果表明，鎘脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞自噬相關(guān)基因ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a的表達(dá)。進(jìn)一步觀(guān)察ATG8a-GFP轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫處理后誘導(dǎo)了大量自噬體產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，細(xì)胞自噬參與應(yīng)答植物的鎘脅迫。另外，有研究表明，擬南芥atg7、atg9、atg4a4b、atg5、atg18a突變體對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏敏感[27]。筆者發(fā)現(xiàn)，atg2、atg5突變體在鎘脅迫下的生長(zhǎng)被抑制，自噬體的形成減少，進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞自噬在植物的鎘脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。干旱和滲透脅迫都可以造成植物細(xì)胞ROS的氧化蛋白的積累，而細(xì)胞自噬有清除氧化蛋白和ROS的能力[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫處理后，atg2、atg5突變體中的ROS含量都比野生型的高，說(shuō)明細(xì)胞自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)的ROS。綜上表明，細(xì)胞自噬可能通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)的ROS來(lái)抵抗鎘脅迫。

由于植物的鎘脅迫機(jī)制十分復(fù)雜，植物鎘脅迫中的許多問(wèn)題仍未有解答。本研究為作物在鎘脅迫下的耐受性研究提供了理論依據(jù)，而關(guān)于細(xì)胞自噬在鎘脅迫中的作用還有待進(jìn)一步研究。

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