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    鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF72基因克隆、蛋白原核表達(dá)和抗體制備

    2019-09-23 06:10:53李雙向濤周海峰
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年14期

    李雙 向濤 周海峰

    摘要:異育銀鯽作為我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類,其鰓出血病為主要病害,并造成重大經(jīng)濟(jì)損失,該病病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-2)。目前,研究主要在該病的檢測和病理方面,對于免疫學(xué)檢測方面研究較少。本研究根據(jù)CyHV-2 ORF72基因序列設(shè)計(jì)了1對特異性引物,利用患病異育銀鯽腎臟DNA作為模板,通過PCR擴(kuò)增得到CyHV-2 ORF72基因全長,該基因序列全長為1 113 bp,可編碼370個(gè)氨基酸的蛋白。該基因與pET-28a表達(dá)載體連接構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-ORF72轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到了分子量約為45 ku的重組蛋白,與預(yù)測的蛋白大小基本一致。將純化的重組蛋白皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大耳兔制備了ORF72的多克隆抗體,經(jīng)Western Blotting檢測抗體能與病毒粗提液有良好反應(yīng),特異性較好,本結(jié)果可為下一步建立疫苗和免疫檢測方法奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:異育銀鯽;鯉皰疹病毒Ⅱ型;ORF72;多克隆抗體;Western Blotting

    中圖分類號:S941.41 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號:1002-1302(2019)14-0062-04

    鯽魚是江蘇省重要的大宗淡水養(yǎng)殖品種之一,在淡水養(yǎng)殖業(yè)中具有重要地位[1-3]。在江蘇省鯽魚精養(yǎng)面積達(dá) 533.3 km2 以上,2011年產(chǎn)量達(dá)54.80萬t,產(chǎn)值約80多億元,居全國首位。隨養(yǎng)殖集約化程度的增高、養(yǎng)殖密度的增大以及養(yǎng)殖水環(huán)境的惡化,鯽魚的病害問題也日益突出,目前已成為威脅鯽魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要因素。在這些病害中,主要以近幾年發(fā)生的鰓出血病最為嚴(yán)重。經(jīng)檢測確認(rèn),引起這種疾病的病原是鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2),該病毒的宿主范圍較窄,僅感染金魚、鯽魚和它們的變種[4-5,8],致死率可高達(dá)90%~100%[4],給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害。

    CyHV-2首次發(fā)病是在日本養(yǎng)殖的金魚中[9],目前該病在美國[4-5]、澳大利亞[5]、我國臺灣省[8]、英國[10]等地均有發(fā)生,其流行情況分布全球。2011—2012年,CyHV-2導(dǎo)致我國養(yǎng)殖的異育銀鯽(Carassius gibelio)出現(xiàn)嚴(yán)重死亡,也是我國大陸異育銀鯽發(fā)生該病的首次報(bào)道[11]。而2013年在江蘇、北京、武漢、廣州等地養(yǎng)殖的異育銀鯽中也被檢測出了CyHV-2,說明CyHV-2在我國已有較為廣泛的分布[12]。

    CyHV-2又稱金魚造血器官壞死病毒(goldfish haematopoietic necrosisvirus,GFHNV)[3,5,13-14]、皰疹病毒性造血器官壞死癥病毒(herpes viral haematopoietic necrosis virus,HVHNV)[5,9]。該病毒是第2個(gè)從鯉科魚中分離出的病毒,因此,國際病毒系統(tǒng)分類與命名委員會(huì)命名其為鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-2)[3,14],與鯉痘瘡病毒(carp pox herpesvirus,cyprinid herpesvirus,CyHV-1)和錦鯉皰疹病毒(koi herpesvirus,cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)統(tǒng)稱為“鯉科魚皰疹病毒目的3個(gè)型”。目前,對該病毒的研究還處于初級階段,世界動(dòng)物組織(OIE)還未將其納入檢疫目錄[12]。CyHV-2為一種線型的雙鏈DNA病毒,包含156個(gè)開放閱讀框(ORF)[1],成熟的病毒粒子外有一層包膜,呈圓形或橢圓形,直徑可達(dá)0.175~0.200 μm[15]。目前,對該病毒的檢測方法和病理學(xué)方面的研究較多,而對其病毒的研究仍較少。分子生物學(xué)診斷方法主要是普通PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等,另外還有細(xì)胞培養(yǎng),電鏡觀察檢測法等。然而,該病毒的免疫學(xué)研究還很少,CyHV-2抗原蛋白的表達(dá)和抗體制備處于萌芽階段??乖鞍妆磉_(dá)和抗體制備對于有效預(yù)防和治療該病毒至關(guān)重要,可為以后該病毒相應(yīng)疫苗的商業(yè)化生產(chǎn)打下堅(jiān)定地基礎(chǔ)。本研究對ORF72基因進(jìn)行原核重組表達(dá),并構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-ORF72,且在新西蘭大耳兔中制備了該重組蛋白的多克隆抗體,為病毒的防治提供了理論基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 載體、菌株及病毒來源

    pET-28原核表達(dá)載體,購自Novagen公司,于筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Transetta(DE3),購自Trangen生物公司。CyHV-2病毒從患有明顯鰓出血病癥狀的異育銀鯽中分離純化獲得,且CyHV-2 PCR檢測陽性。

    1.2 試驗(yàn)試劑

    DNA純化回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)、Prime star Max Premix(2×)、DL2 000 DNA Marker、Taq DNA聚合酶,均購自Tiangen生物公司。Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶,均購自TaKaRa生物公司。2種弗氏佐劑(完全和不完全),購自Sigma公司,DNA蛋白分子標(biāo)準(zhǔn),購自Fermentas公司;胰蛋白胨,購自Solarbio公司;考馬斯亮藍(lán),購自南京建成生物工程研究所;高純質(zhì)粒小量制備試劑盒,購自北京百泰克生物科技有限公司;LB營養(yǎng)瓊脂,購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

    1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

    根據(jù)CyHV-2 ORF72基因序列,利用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)的引物,由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

    1.4 CyHV-2 ORF72基因擴(kuò)增

    使用DNA提取試劑盒,根據(jù)說明書操作步驟提取患病異育銀鯽腎臟總DNA作為擴(kuò)增模板。25 μL PCR反應(yīng)體系:滅菌雙蒸水9.5 μL,10 μmol/L上下游引物各自1 μL,DNA模板1 μL,Prime star Max Premix (2×)12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性4 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火 5 s,72 ℃延伸10 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。將擴(kuò)增完的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

    1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及篩選

    將擴(kuò)增的目的片段和pET-28a運(yùn)用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后,1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離,使用膠回收試劑盒對DNA進(jìn)行回收和純化。之后T4連接酶將兩者連接構(gòu)成重組質(zhì)粒pET-ORF72。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E. coli Trans1 T1中,經(jīng)PCR、酶切鑒定和測序以確定讀碼框正確無誤。

    1.6 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)及重組蛋白的純化

    將篩選出測序正確的陽性重組質(zhì)粒pET-ORF72轉(zhuǎn)化到表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21中,培養(yǎng)至D600 nm為0.6~0.8時(shí),加入IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h,離心收集菌液,經(jīng)超聲波破碎裂解后離心出上清和沉淀,分別進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,最后采用His-tag親和層析柱按照說明書步驟對目的蛋白進(jìn)行純化。

    1.7 Western blot檢測

    將病毒粗提液先進(jìn)行SDS-PAGE電泳;然后取出凝膠置于緩沖液中平衡10~15 min;剪出和膠同等大小的PVDF膜和濾紙,用甲醇浸潤膜20 s,再用無菌水浸洗2 min,再與濾紙一起放轉(zhuǎn)移平衡液中平衡20 min;負(fù)極向正極轉(zhuǎn)膜,按順序放置好3層濾紙、凝膠、3層PVDF膜,注意避免產(chǎn)生氣泡;將組裝好的槽心裝入轉(zhuǎn)移裝置后加入充足轉(zhuǎn)移緩沖液,冰浴條件下250~300 mA轉(zhuǎn)移90~100 min;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜置于平皿中,用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h;用TBST每隔10 min洗1次,共洗4次后加入ORF72多克隆抗體,4 ℃孵育過夜;再用TBST同上洗滌4次后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體室溫下孵育1 h;洗滌4次后用顯色劑顯色后將膜放入雙蒸水中終止反應(yīng),最后用凝膠成像儀進(jìn)行曝光。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增

    利用患病異育銀鯽腎臟提取的CyHV-2 DNA作為擴(kuò)增模板,使用設(shè)計(jì)的相應(yīng)特異性引物(表1),通過PCR擴(kuò)增得到CyHV-2 ORF72目的基因。CyHV-2 ORF72基因序列全長為1 113 bp,其長度和預(yù)期一致(圖1)。

    2.2 CyHV-2 ORF72重組蛋白的表達(dá)

    將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中,誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)后使其終濃度為238.30 mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌6 h后超聲破碎離心出上清和沉淀后,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分析。由圖2可知,重組融合蛋白ORF72表達(dá)明顯,可誘導(dǎo)出分子量約為45 ku(1 u=1 g/mol)的重組蛋白, 與預(yù)測蛋白大小基本一致;在沒有IPTG劑誘導(dǎo)時(shí),目的蛋白不表達(dá)。

    2.3 CyHV-2 ORF72重組蛋白的純化

    利用親和層析法對重組表達(dá)的CyHV-2 ORF72蛋白進(jìn)行純化,將收集到的穿透液和洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分析(圖3)。目的蛋白進(jìn)行純化后濃度較高,且分子量為 45 ku 處得到單一條帶。

    2.4 CyHV-2 ORF72純化蛋白多克隆抗體的Western blot驗(yàn)證

    利用純化的原核重組ORF72蛋白,與佐劑等量混合后分4次腹部皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大耳兔,每次間隔1周,以制備ORF72的多克隆抗體,并利用Western blotting方法檢測純化的ORF72的多克隆抗體效果,結(jié)果顯示制備的多克隆抗體能與病毒粗提液有良好的反應(yīng)。由圖4可知,其特異性好,可見單一條帶,為后續(xù)建立免疫檢測方法奠定了一定基礎(chǔ)。

    3 討論

    異育銀鯽具有生長快、食性雜、易飼養(yǎng)、肉質(zhì)鮮美、蛋白質(zhì)豐富等優(yōu)點(diǎn),受到廣大消費(fèi)者的青睞,成為主要淡水經(jīng)濟(jì)魚類。隨著養(yǎng)殖密度的加大和水環(huán)境的管理欠缺,病害發(fā)生越來越多,制約了異育銀鯽的發(fā)展,影響了社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。異育銀鯽的常見病害主要有細(xì)菌性疾病,如細(xì)菌性敗血癥[16]等;真菌性疾病,如水霉病[17]等;寄生蟲病,如黏孢子蟲病[18]等。近年來,異育銀鯽鰓出血病發(fā)病頻繁,成為其主要病害。2011年至今,鰓出血病以極快的速度蔓延,發(fā)病死亡面積已達(dá)到約66.67 km2,造成的經(jīng)濟(jì)損失已達(dá)數(shù)億元。2012年[11]和2013年[2]經(jīng)現(xiàn)場診斷調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室病原分離與鑒定研究,獲得人工感染試驗(yàn)、組織病理學(xué)、超薄切片電鏡觀察、分子診斷、病毒培養(yǎng)等關(guān)鍵性試驗(yàn)數(shù)據(jù),確認(rèn)近年在我國江蘇大部分地區(qū)暴發(fā)的養(yǎng)殖鯽魚出血病為皰疹病毒性造血器官壞死癥,其病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)。

    目前,病毒檢測的主要手段為PCR,CyHV-2的PCR檢測方法已有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[20]、微滴式數(shù)字快速PCR檢測方法[21]、雙重快速PCR[22]、Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR[23-24]。另外,薛忠儀等運(yùn)用chelex建立了一種快速檢測該病毒的PCR方法[17]。除PCR檢測法外,還有電鏡觀察、細(xì)胞培養(yǎng)的方法去檢測病毒的存在。電鏡觀察法比較直觀,能夠直接看到患病魚體組織內(nèi)病毒的有無。Jung等通過電鏡技術(shù)首次觀察到了患病金魚脾、腎組織細(xì)胞中感染的CyHV-2粒子[9];Groff等采用電鏡觀察瀕死金魚幼魚的鰓和腎組織的超薄切片,也證實(shí)了感染細(xì)胞內(nèi)CyHV-2粒子的存在[10];Chang等通過電鏡技術(shù)也在瀕死的金魚組織細(xì)胞內(nèi)觀察到CyHV-2粒子[8]。Wang等通過電鏡發(fā)現(xiàn)在肝和脾能觀察到最明顯的組織病理學(xué)變化[10]。Wu等通過電鏡也發(fā)現(xiàn)了患病魚腎、脾、肝、鰓、腸道等組織的不同損傷和壞死[2]。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前用到的不多,由于CyHV-2通過細(xì)胞培養(yǎng)繁殖幾代后就失去其活性,所以很難在魚類病毒分離常用的細(xì)胞系中進(jìn)行增殖傳代,一般傳3~4代就會(huì)失去活性,馬杰等建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系,CyHV-2在GiCB細(xì)胞上連續(xù)傳代到第6代仍可檢測到病毒核酸且病變穩(wěn)定[25]。

    目前,對CyHV-2的免疫學(xué)檢測相關(guān)的研究還較少,因此免疫學(xué)研究更有意義,可篩選出病毒相關(guān)蛋白制備出相應(yīng)抗體,為病毒疫苗的商業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ),能夠有效解決病毒的危害問題。彭俊杰等原核表達(dá)了ORF25蛋白及制備了其單克隆抗體[15];周勇等原核表達(dá)了ORF4蛋白并制備了其多克隆抗體,并用ELISA和間接免疫熒光檢測了抗體可以和該病毒良好地特異性結(jié)合[3];廖紅等成功克隆了ORF5截短基因并且成功原核表達(dá)出蛋白,通過攻毒實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該融合蛋白具有一定的免疫原性[1]。本研究利用CyHV-2-ORF72基因設(shè)計(jì)出其特異性引物進(jìn)行了基因的克隆、蛋白的表達(dá)和純化試驗(yàn),并且利用新西蘭大白兔制備了多克隆抗體,并且經(jīng)Western blotting分析可見其特異性良好。本試驗(yàn)的表達(dá)系統(tǒng)為原核表達(dá)載體pET-28a和大腸桿菌,該系統(tǒng)與其他系統(tǒng)相比具有很高的表達(dá)效率,能夠良好地表達(dá)出目的蛋白,運(yùn)用的大腸桿菌具有周期短、易培養(yǎng)、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[26]。本試驗(yàn)成功表達(dá)出ORF72蛋白,并且利用該純化的蛋白免疫新西蘭大白兔獲得了抗體,為下一步組裝ELISA試劑盒和 CyHV-2 免疫膠體金試紙條奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為探討重組表達(dá)的ORF72蛋白是否能作為疫苗使用奠定了基礎(chǔ),有利于對該病毒疫苗進(jìn)行商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn),可加快對CyHV-2病毒的免疫學(xué)檢測辦法實(shí)踐于養(yǎng)殖異育銀鯽的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中可便利準(zhǔn)確檢測該病病原,并且能高效地進(jìn)行室內(nèi)室外自身檢測病原,這對于及時(shí)發(fā)現(xiàn)及治療鰓出血病,減少異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)及水產(chǎn)行業(yè)的損失,具有重大意義。

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