蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體的制備及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

王詩(shī)琪,鐘照恬,易 陽(yáng),*,閔 婷,王麗梅

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023; 2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

蓮藕是我國(guó)種植面積最大、產(chǎn)量最高的水生蔬菜,富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等,且據(jù)古醫(yī)書(shū)記載連藕具有清熱止血、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、滋陰安神等功效[1-2]。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究可知,蓮藕及其提取物具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血壓、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抑菌等作用,而多酚和多糖是其主要的功能因子[3-6]。但是,關(guān)于蓮藕功能性產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)鮮見(jiàn)報(bào)道。

目前,關(guān)于植物功能性成分的提取開(kāi)發(fā)主要包括:提取制備濃縮液、提取干制為粉劑、制成(復(fù)合)片劑或脂質(zhì)體等。大量研究報(bào)道了蓮藕多酚和多糖的提取工藝[7-8],但極少涉及相關(guān)提取物的產(chǎn)品制備。脂質(zhì)體作為一種生物降解性和生物相容性功能性成分載體,具備一定的靶向性和緩釋性,具有減少功能性成分用量、提高利用率、增強(qiáng)功能成分穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)受到廣泛的關(guān)注[9-11]。馬寧等[12]采用乙醇注入-超聲法制備茶多酚脂質(zhì)體,提高茶多酚的穩(wěn)定性和生物利用率,從而拓展其在食品及工業(yè)中的應(yīng)用;Wu等[13]采用逆向蒸發(fā)法制備甘草多糖脂質(zhì)體,增強(qiáng)了甘草多糖的免疫活性;而Fan等[14]制備淫羊藿多糖和蜂膠黃酮的復(fù)合脂質(zhì)體,該脂質(zhì)體相比于單一脂質(zhì)體更穩(wěn)定,且起到了協(xié)同增效的作用。當(dāng)前,對(duì)蓮藕多糖和多酚的研究主要集中在提取、分離純化、結(jié)構(gòu)/組成分析以及活性評(píng)價(jià)等方面[3-8],關(guān)于脂質(zhì)體的開(kāi)發(fā)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文分離純化蓮藕中多糖和多酚,采用逆向蒸發(fā)法制備其復(fù)合脂質(zhì)體,以多糖和多酚的包封率為指標(biāo),結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化其配方與工藝,然后進(jìn)一步考察脂質(zhì)體在不同貯藏形式和條件下的穩(wěn)定性,以期為蓮藕功能成分的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮蓮藕 武漢市金水祺良農(nóng)副產(chǎn)品有限公司,鄂蓮5號(hào);大豆卵磷脂 上海源葉生物科技有限公司,純度>90%;膽固醇 上海源葉生物科技有限公司,純度>95%;Triton X-100、沒(méi)食子酸和Folin-Ciocalteu試劑 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;HPD-100大孔樹(shù)脂 上海摩速科學(xué)器材有限公司,分析純;HiPrepSephacryl S-100凝膠 美國(guó)GE Healthcare公司。

XHF-D型高速分散器 寧波新芝科技股份有限公司;UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津有限公司;RE-200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;Nano-ZS90 型納米粒度和Zeta電位儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司;SB-5200型超聲清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蓮藕多酚和多糖的分離純化 參考徐燕燕[15]的方法提取蓮藕多酚,取新鮮蓮藕切碎至蓮藕渣,按料液比為1∶20 (g/mL)加入40%濃度乙醇,采用勻漿機(jī)以10000 r/min轉(zhuǎn)速處理5 min。勻漿由乙酸調(diào)節(jié)至pH3,置于200 W超聲場(chǎng)中持續(xù)浸提72 min,經(jīng)4500 r/min離心10 min分離上清液。過(guò)濾上清液后得到多酚粗提液,60 ℃真空濃縮后,放置于-20 ℃冰柜保存。采用HPD-100型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附純化多酚,得到多酚純度為58.21%,主要由沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素和兒茶素組成。

參考王瑜[16]的方法提取蓮藕多糖,取新鮮蓮藕切碎至蓮藕渣再稱取100 g加入1.5 L蒸餾水,采用高速勻漿機(jī)以8000 r/min轉(zhuǎn)速均質(zhì)處理5 min,置于90 ℃熱水浴中浸提2 h。浸提結(jié)束后4500 r/min離心10 min分離上清液。并將上清液過(guò)濾后于65 ℃真空濃縮約至200 mL。濃縮液加入無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)乙醇體積濃度至30%或40%,于4 ℃靜置6 h后離心(4500 r/min,10 min)除去沉淀,調(diào)節(jié)乙醇體積濃度至80%繼續(xù)靜置6 h沉淀無(wú)淀粉多糖。離心分離沉淀,采用80%乙醇洗滌后蒸發(fā)乙醇,用適量蒸餾水溶解并冷凍干燥得到蓮藕粗多糖。提取的多糖采用HiPrepSephacryl S-100凝膠過(guò)濾層析純化,得到多糖純度為51.31%,其結(jié)構(gòu)為[α-D-Glc(1-4)-]n型葡聚糖。

1.2.2 蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體的制備工藝 參考李唐棣[25]的方法并略做修改,采用逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體。取一定量的磷脂與膽固醇作為膜材,以10 mL含有一定量蓮藕多酚的40%乙醇溶液溶解膜材,與30 mL含有一定量蓮藕多糖的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH=7.4)混合,40 kHz,300 W下超聲處理一定時(shí)間;于55 ℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮,直至圓底燒瓶上形成均勻膠狀薄膜;加入磷酸鹽緩沖液旋轉(zhuǎn)使凝膠脫落,用高速分散器在一定轉(zhuǎn)速下剪切處理為均勻的脂質(zhì)體混懸液。另在同樣的條件下制備不含蓮藕多酚和多糖的空白脂質(zhì)體。

1.2.3 蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體制備的單因素實(shí)驗(yàn) 取多酚質(zhì)量濃度15 mg/mL多糖質(zhì)量濃度1.5 mg/mL、磷脂-膽固醇質(zhì)量比4∶1、超聲處理時(shí)間6 min、高速剪切轉(zhuǎn)速8000 r/min為復(fù)合脂質(zhì)體制備的基本工藝參數(shù),分別變換多酚質(zhì)量濃度5、10、15、20和25 mg/mL;多糖質(zhì)量濃度1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg/mL;磷脂-膽固醇質(zhì)量比1∶10、1∶8、1∶6、1∶4和1∶2;超聲處理時(shí)間3、6、9、12和15 min;高速剪切轉(zhuǎn)速4000、6000、8000、10000和12000 r/min,考察以上因素對(duì)蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體包封率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定影響脂質(zhì)體的包封率的主要因素為多酚質(zhì)量濃度、多糖質(zhì)量濃度及磷脂-膽固醇質(zhì)量比,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,固定超聲時(shí)間為6 min、高速剪切轉(zhuǎn)速為8000 r/min,設(shè)計(jì)L9(43)正交試驗(yàn)優(yōu)化蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體制備的配方,因素及水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素及其水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體的試樣制備及穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 按優(yōu)化配方和工藝參數(shù)制備蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體,采用磷酸鹽緩沖液定容至原體積的1/4。取2.5 mL脂質(zhì)體懸濁液至西林瓶中,經(jīng)-20 ℃預(yù)凍 24 h后于-55 ℃冷凍干燥36 h得凍干脂質(zhì)體復(fù)合物,密封保存用于穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。

將脂質(zhì)體懸濁液分裝于9組西林瓶中,每組3瓶,每瓶2.5 mL。其中1組用于分析脂質(zhì)體初始特征(多酚包封率、多糖包封率、Zeta電位和粒徑分布),另8組分別置于4 ℃和25 ℃條件下保存24、48、72和96 h后進(jìn)行分析[17]。

取9組含凍干脂質(zhì)體粉末的西林瓶(每組3瓶),其中1組每瓶加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液重建后分析凍干脂質(zhì)體初始特征,另8組分別置于4 ℃和25 ℃條件下保存5、10、15和20 d后進(jìn)行脂質(zhì)體重建與分析[17]。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 多酚和多糖包封率的測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定多酚質(zhì)量濃度[18],結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示。參考王文等[19]的方法,采用苯酚硫酸法檢測(cè)多糖含量,結(jié)果以葡萄糖當(dāng)量表示。基于脂質(zhì)體游離多酚(游離多糖)和總多酚(總多糖)的質(zhì)量濃度按如下公式計(jì)算復(fù)合脂質(zhì)體的包封率(EE):

包封率(EE,%)=(Ct- Cf)/Ct×100

式中:Ct為總酚(總多糖)濃度,mg/mL;Cf為游離多酚(多糖)濃度,mg/mL;EE為包封率,%。

1.2.6.2 粒徑和Zeta電位分布測(cè)定 取復(fù)合脂質(zhì)體樣品稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù),加入樣品池中,用Nano-ZS90 型納米粒度和Zeta電位儀測(cè)定其粒徑分布和Zeta電位[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示(n=3)。采用SPSS 19.0軟件S-N-K檢驗(yàn)分析組間數(shù)據(jù)顯著性差異(0.05水平)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 多酚質(zhì)量濃度對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響 由圖1可知,隨著蓮藕多酚質(zhì)量濃度的增加,脂質(zhì)體的多酚包封率先增后減,各組間差異顯著(P<0.05),在多酚質(zhì)量濃度15 mg/mL時(shí)獲得最大多酚包封率70.27%,此時(shí)多酚的包封可能達(dá)到飽和。而多糖包封率則隨蓮藕多酚質(zhì)量濃度的增加顯著降低(P<0.05),直至多酚質(zhì)量濃度超過(guò)15 mg/mL后趨于穩(wěn)定(P>0.05),這一結(jié)果與曠英姿的研究相似[21]。為了獲得相對(duì)高的多酚包封率,選擇蓮藕多酚添加質(zhì)量濃度為10～20 mg/mL。

圖1 蓮藕多酚質(zhì)量濃度對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響Fig.1 Effect of lotus root polyphenol content on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.2 多糖質(zhì)量濃度對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響 由圖2可知,當(dāng)多糖質(zhì)量濃度由1.0 mg/mL增加至1.5 mg/mL,多糖包封率和多酚包封率均未發(fā)生顯著變化(P>0.05),但隨后呈現(xiàn)截然不同的變化趨勢(shì):多糖包封率顯著增加(P<0.05),繼而維持穩(wěn)定(P>0.05),這一現(xiàn)象與趙永新的研究結(jié)果基本一致[22];多酚包封率顯著下降(P<0.05),后在多糖質(zhì)量濃度2.0～2.5 mg/mL之間維持穩(wěn)定水平(P>0.05),而在多糖質(zhì)量濃度3.0 mg/mL時(shí)，多酚包封率最低(25.10%),這可能與多糖與多酚的非共價(jià)相互作用機(jī)制有關(guān)[23],多酚與多糖通過(guò)非共價(jià)作用形成聚合物增大了顆粒直徑,導(dǎo)致多酚的包封率下降。為了獲得相對(duì)較高的多糖包封率,選擇蓮藕多糖添加質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL。

圖2 蓮藕多糖質(zhì)量濃度對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響Fig.2 Effect of lotus root polysaccharide content on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.3 磷脂-膽固醇質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響 磷脂-膽固醇質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響如圖3所示。蓮藕多糖和多酚的包封率均呈先上升后下降的趨勢(shì),且二者均在磷脂-膽固醇質(zhì)量比為1∶4時(shí)達(dá)最大值(P<0.05),分別為15.12%和77.61%。在茶多酚脂質(zhì)體制備的研究中優(yōu)化的最佳配方中磷脂-膽固醇比為3∶1[24],而本實(shí)驗(yàn)中添加了大量多糖成分,增強(qiáng)了其水溶性,則需要提高膽固醇的量以提高包封率[25]。膽固醇是脂質(zhì)體類(lèi)脂膜的重要組成部分,添加適量的膽固醇可以增加脂質(zhì)雙分子膜中脂質(zhì)分子排列的緊密程度,調(diào)節(jié)磷脂分子膜的流動(dòng)性,有助于減輕加熱時(shí)脂質(zhì)分子烴基的彎曲程度,從而起到穩(wěn)定脂膜和減少滲漏作用。但膽固醇增加過(guò)多可能增加脂質(zhì)雙分子膜不對(duì)稱性,因而更易導(dǎo)致膜的不穩(wěn)定,使包封內(nèi)容物滲漏[26-27],為獲得較高的脂質(zhì)體包封率,選擇磷脂-膽固醇質(zhì)量比為1∶4。

圖3 磷脂-膽固醇質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響Fig.3 Effect of phospholipid-cholesterol mass ratio on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.4 超聲處理時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響 由圖4可見(jiàn),隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng),蓮藕多糖和多酚的包封率均呈先升后降的趨勢(shì),且二者均在超聲處理6 min時(shí)達(dá)到最大包封率(P<0.05),分別為14.83%和70.12%。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),復(fù)合脂質(zhì)體的粒徑和分散系數(shù)可以不同程度地減小,有助于提高包封率,但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),脂質(zhì)體磷的雙分子層被破壞,導(dǎo)致脂質(zhì)體破裂[28]。故而,超聲處理時(shí)間以6 min為宜。

圖4 超聲處理時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.5 高速剪切轉(zhuǎn)速對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響 由圖5可知,蓮藕多糖和多酚的包封率均隨著高速剪切轉(zhuǎn)速的增加先增后減,二者均在8000 r/min時(shí)獲得最大包封率(P<0.05),分別為16.24%和77.09%。增加剪切轉(zhuǎn)速有助于形成狀態(tài)穩(wěn)定、大小較均一的脂質(zhì)體混懸液,但是轉(zhuǎn)速過(guò)大容易引起復(fù)合脂質(zhì)體膜破裂,包封內(nèi)容物泄漏[26-27]。故脂質(zhì)體混懸液高速剪切轉(zhuǎn)速選擇8000 r/min為宜。

圖5 高速剪切轉(zhuǎn)速對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響Fig.5 Effect of rotational speed on the encapsulation efficiency of liposomes

2.2 蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體的配方優(yōu)化

通過(guò)正交設(shè)計(jì)確定復(fù)合脂質(zhì)體配方。在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了影響復(fù)合脂質(zhì)體包封率的主要因素:蓮藕多酚質(zhì)量濃度、蓮藕多糖質(zhì)量濃度和磷脂-膽固醇質(zhì)量比。因此設(shè)計(jì)L9(43)正交試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 復(fù)合脂質(zhì)體配方優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The orthogonal experiment design and results of formulation optimization for the liposome complex

由表2極差分析和表3方差分析可知,各因素對(duì)蓮藕多酚包封率和多糖包封率的影響均依次為:磷脂-膽固醇質(zhì)量比(C)>多酚質(zhì)量濃度(A)>多糖質(zhì)量濃度(B),僅磷脂-膽固醇質(zhì)量比(C)及多酚質(zhì)量濃度(A)對(duì)蓮藕多酚包封率有顯著影響(P<0.05)。包封蓮藕多酚的最優(yōu)組為A2B2C2,包封蓮藕多糖的最優(yōu)組為A2B3C2,因?yàn)槎嗵琴|(zhì)量濃度對(duì)多酚和多糖包封率均無(wú)顯著影響(P>0.05),為減少多糖添加量,確定復(fù)合脂質(zhì)體制備的最優(yōu)配方為A2B2C2即:蓮藕多酚質(zhì)量濃度15 mg/mL,蓮藕多糖質(zhì)量濃度1.5 mg/mL,磷脂-膽固醇質(zhì)量比1∶4。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),在該條件下所得脂質(zhì)體的多酚包封率為72.36%±2.83%,多糖包封率為15.66%±1.01%,電位為-(38.70±0.39) mV,粒徑為(123.01±0.97) nm。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

2.3 蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體的穩(wěn)定性

2.3.1 貯藏過(guò)程中脂質(zhì)體的多酚和多糖包封率變化 包封率是判斷脂質(zhì)體穩(wěn)定性的主要指標(biāo)之一,隨著貯藏時(shí)間的增加,4和25 ℃貯藏液態(tài)復(fù)合脂質(zhì)體和凍干脂質(zhì)體的多酚包封率在不同階段均發(fā)生顯著下降(P<0.05)。如圖6(Ⅰ)所示,在4 ℃貯藏96 h后液態(tài)脂質(zhì)體多酚包封率由72.36%降至49.28%,而25 ℃下則降至25.09%,包封率降幅分別為23.08%和47.27%;如圖6(Ⅱ)所示,凍干脂質(zhì)體在4 ℃貯藏20 d后多酚包封率由72.66%降至65.13%,而25 ℃下則降至57.66%,包封率降幅分別為7.53%和15.00%。兩種脂質(zhì)體在相同貯藏時(shí)間下(貯藏24 h后),4 ℃的多酚包封率均顯著高于25 ℃,說(shuō)明低溫有利于脂質(zhì)體的貯藏,與楊培民[20]中使用的低溫貯藏的方式制備的白花蛇舌草黃酮苷元脂質(zhì)體的穩(wěn)定性高于高溫實(shí)驗(yàn)下的脂質(zhì)體這一研究結(jié)果一致。同時(shí),相比于液態(tài)脂質(zhì)體,凍干脂質(zhì)體在相同條件下儲(chǔ)藏相同時(shí)間其多酚包封率下降幅度明顯減小,說(shuō)明凍干脂質(zhì)體更有利于長(zhǎng)期儲(chǔ)藏,這可能與凍干脂質(zhì)體水分少,易氧化成分更加穩(wěn)定有關(guān)[29]。

圖6 蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體貯藏過(guò)程中的多酚包封率變化Fig.6 Changes of encapsulation efficiency of polyphenols during storage of lotus root polyphenol-polysaccharide complex liposomes注:圖Ⅰ為液態(tài)脂質(zhì)體,圖Ⅱ?yàn)閮龈芍|(zhì)體; 不同小寫(xiě)字母表示在4 ℃溫度下,不同貯藏時(shí)間 脂質(zhì)體的多酚包封率的差異顯著P<0.05;不同大寫(xiě) 字母表示在25 ℃溫度下,不同貯藏時(shí)間脂質(zhì)體的 多酚包封率的差異顯著P<0.05;圖7～圖9同。

不同貯藏溫度下,時(shí)間對(duì)液態(tài)復(fù)合脂質(zhì)體多糖包封率和凍干脂質(zhì)體多糖包封率的影響,如圖7所示。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),4 ℃和25 ℃貯藏液態(tài)復(fù)合脂質(zhì)體和凍干脂質(zhì)體的多糖包封率在不同階段均顯著下降(P<0.05),如圖7(Ⅰ)所示。4 ℃貯藏96 h后多糖包封率由15.67%降至6.81%,而25 ℃下則降至6.23%,包封率降幅分別為8.86%和9.44%;凍干脂質(zhì)體在4 ℃貯藏20 d后多糖包封率由15.55%降至11%,而25 ℃下則降至9.45%,包封率降幅分別為4.55%和6.1%。兩種脂質(zhì)體在相同貯藏時(shí)間下(貯藏24 h后),4 ℃的多糖包封率均高于25 ℃,說(shuō)明低溫有利于脂質(zhì)體的貯藏,高金芝等[30]將人參皂苷Re凍干脂質(zhì)體置于4 ℃下貯藏10 d,發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)無(wú)明顯變化,而40 ℃及60 ℃下各指標(biāo)穩(wěn)定性較差。同時(shí),相比于液態(tài)脂質(zhì)體,凍干脂質(zhì)體在相同條件下儲(chǔ)藏相同時(shí)間其多糖包封率下降幅度明顯減小,這一現(xiàn)象與Strauss[31]的研究相符。

圖7 蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體貯藏過(guò)程中的多糖包封率變化Fig.7 Changes of polysaccharide encapsulation rate of lotus root polyphenol-polysaccharide complex liposomes during storage

2.3.2 貯藏過(guò)程中脂質(zhì)體的電位變化 脂質(zhì)體在溶液中的運(yùn)動(dòng)與荷電膠體粒子相似,通過(guò)改變組分的荷電性質(zhì)和荷電量及介質(zhì)的離子強(qiáng)度,可以使電位保持在足夠高的水平,并減少顆粒相互間的聚沉和融合,增加穩(wěn)定性[22]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),4 ℃和25 ℃貯藏液態(tài)復(fù)合脂質(zhì)體電位和凍干脂質(zhì)體電位的絕對(duì)值在不同階段均顯著下降(P<0.05),如圖8所示。液態(tài)脂質(zhì)體在4 ℃貯藏96 h后復(fù)合脂質(zhì)體電位的絕對(duì)值由38.70降至26.97,而25 ℃下則降至25.40,復(fù)合脂質(zhì)體電位的絕對(duì)值降幅分別為11.73和13.30;凍干脂質(zhì)體在4 ℃貯藏20 d后復(fù)合脂質(zhì)體電位的絕對(duì)值由38.70降至35.80,而25 ℃下則降至28.97,復(fù)合脂質(zhì)體電位的絕對(duì)值降幅分別為2.90和9.73。相同貯藏時(shí)間下(貯藏24 h后),4 ℃的復(fù)合脂質(zhì)體電位的絕對(duì)值顯著均高于25 ℃,說(shuō)明低溫有利于脂質(zhì)體的貯藏。同時(shí),相比于液態(tài)脂質(zhì)體,凍干脂質(zhì)體在相同條件下儲(chǔ)藏相同時(shí)間其脂質(zhì)體電位下降幅度明顯減小。

圖8 蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體貯藏過(guò)程中脂質(zhì)體的電位變化Fig.8 Changes of potential of lotus root polyphenol- polysaccharide complex liposome during storage

2.3.3 貯藏過(guò)程中脂質(zhì)體的粒徑變化 脂質(zhì)體的大小直接影響包埋物質(zhì)的載量、釋放、利用率以及生物體內(nèi)分布和靶向性,控制粒子的大小和獲得較窄且均勻的粒度分布是制備納米制劑的關(guān)鍵[25]。隨著貯藏時(shí)間的增加,4 ℃和25 ℃貯藏液態(tài)復(fù)合脂質(zhì)體的粒徑與凍干脂質(zhì)體的粒徑在不同階段均發(fā)生顯著增加(P<0.05),如圖9所示。液態(tài)脂質(zhì)體在4 ℃貯藏96 h后復(fù)合脂質(zhì)體的粒徑由123.10 nm增加至151.17 nm,而25 ℃下則增至157.63 nm,復(fù)合脂質(zhì)體的粒徑增加了22.80%和28.05%;凍干脂質(zhì)體在4 ℃貯藏20 d后復(fù)合脂質(zhì)體的粒徑由123.10 nm增加至128.47 nm,而25 ℃下則增至135.37 nm,復(fù)合脂質(zhì)體的粒徑增加了4.36%和9.97%相同貯藏時(shí)間下(貯藏24 h后)。4 ℃的復(fù)合脂質(zhì)體的粒徑均小于25 ℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂質(zhì)體儲(chǔ)藏時(shí)會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)造成凝聚沉淀,而在冷藏條件下可延緩此變化,與參考文獻(xiàn)中低溫貯藏可以減緩白花蛇舌草脂質(zhì)體復(fù)合物的粒子沉降速度這一研究結(jié)果一致[20]。同時(shí),相比于液態(tài)脂質(zhì)體,凍干脂質(zhì)體在相同條件下儲(chǔ)藏相同時(shí)間其脂質(zhì)體粒徑增大幅度明顯減小,這一結(jié)果與Cavalli R的研究相符合[32]。

圖9 蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體貯藏過(guò)程中脂質(zhì)體的粒徑變化Fig.9 Changes of particle size of lotus root polyphenol- polysaccharide complex liposome during storage

3 結(jié)論

采用逆向蒸發(fā)法制備蓮藕多糖-多酚復(fù)合脂質(zhì)體,得出蓮藕多糖-多酚復(fù)合脂質(zhì)體最佳制備工藝為:磷脂-膽固醇質(zhì)量比為1∶4、蓮藕多酚質(zhì)量濃度為15 mg/mL、蓮藕多糖質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL、超聲時(shí)間6 min、高速剪切轉(zhuǎn)速為8000 r/min。在該工藝條件下所得脂質(zhì)體的電位為-38.70 mV、粒徑為123.01 nm、蓮藕多酚包封率為72.36%、多糖包封率為15.66%。同時(shí)考察不同貯藏條件對(duì)蓮藕多糖-多酚復(fù)合脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)凍干脂質(zhì)體的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于液態(tài)脂質(zhì)4 ℃,而低溫(4 ℃)有利于脂質(zhì)體保存。在4 ℃下,凍干脂質(zhì)體貯藏20 d與液體脂質(zhì)體放置24 h的包封率相近,蓮藕多酚包封率約65%、多糖包封率約11%,綜上所述,相比單一脂質(zhì)體,凍干的蓮藕多酚-多糖復(fù)合脂質(zhì)體具有更高的穩(wěn)定性和生物利用率,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為蓮藕功能產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了一定的參考。