仙人掌多酚超聲輔助醇提工藝優(yōu)化及抗氧化、降脂能力分析

王 婧 郭 陽 包怡紅 田 雪 李 歡 邱雋蒙

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

米邦塔仙人掌是一種原產(chǎn)于墨西哥的食用性仙人掌，中國農(nóng)業(yè)部優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品開發(fā)中心自1998年引進米邦塔仙人掌以來，在國內(nèi)進行了引種及推廣，目前作為一種新型保健蔬菜已逐步進入消費者的餐桌[1]。高翔等[2-4]的研究顯示，米邦塔仙人掌中含有豐富的營養(yǎng)成分，包括礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、纖維素及多種維生素，同時富含鎂、錳、銅、鋅等微量元素，是一種營養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)蔬菜。季慧等[5]研究表明，米邦塔仙人掌中含有多種活性功能成分，如多糖、多酚、黃酮、超氧化物歧化酶(SOD)、生物堿類化合物和有機酸類等。已有徐叢玥等[6-8]、朱凱等[9]分別研究了米邦塔仙人掌中的多糖和黃酮。

植物多酚又稱植物單寧。研究[10]表明：植物多酚具有抗氧化、抑菌消炎、抗病毒、抗癌等多種生物學(xué)功能，因此植物多酚作為天然抗氧化劑及食品功能成分，一直是研究的熱點。然而已有的文獻對米邦塔仙人掌中多酚的研究較少，Andreu等[11]曾對西班牙地中海仙人掌枝葉和果實的總酚含量及理化性質(zhì)進行分析，但未對其生理活性如體外降脂功能進行測定。試驗以米邦塔仙人掌為原料，擬采取超聲波輔助法制備多酚提取物，以多酚含量及DPPH自由基清除力為指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)化最佳工藝條件，并對其抗氧化活性及其降血脂能力進行評價，為米邦塔仙人掌的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

米邦塔仙人掌：產(chǎn)于江蘇宿遷；

胃蛋白酶(30 000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c：生化試劑，北京博奧拓達有限公司；

無水乙醇、沒食子酸、抗壞血酸、1, 1-二苯-2-苦基肼、水楊酸、鄰苯三酚、水楊酸：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：YP2002型，上海佑科儀器儀表有限公司；

高速萬能粉碎機：PW-100型，天津泰斯特儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-300DE型，300 W，昆明市超聲儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240型，上海一恒科技有限公司；

臺式離心機：TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

可見分光光度計：722型，上海光譜儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：TU-1810型，北京善析通用儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

三孔電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料處理 取新鮮米邦塔仙人掌，去皮，切塊(1 cm×1 cm×1 cm)，60 ℃恒溫干燥至恒重，粉碎過60目篩，備用。

1.2.2 多酚含量測定 采用紫外分光光度法。配制質(zhì)量濃度分別為1，5，10，15，20，25 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，在190～400 nm波長下進行光譜掃描，重復(fù)操作3次，測定266 nm波長處的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0～25 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性回歸方程為：Y=0.047 7x-0.002 9，R2=0.999 7。將上清液稀釋20倍，測定其吸光度并計算多酚含量，重復(fù)3次[12-13]。

1.2.3 DPPH自由基清除率測定 根據(jù)文獻[14]的方法進行測定，按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

Q——清除率，%；

A0——2 mL無水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光度值；

A1——2 mL待測液加2 mL DPPH溶液的吸光度值；

A2——2 mL待測液加2 mL無水乙醇的吸光度值。

1.2.4 提取工藝單因素試驗設(shè)計

(1) 乙醇濃度對多酚提取率及DPPH自由基清除能力的影響：在料液比1∶20(g/mL)，乙醇濃度(體積分數(shù))分別為50%，60%，70%，80%，90%，溫度50 ℃條件下超聲50 min，將提取液在4 000 r/min下離心20 min，取上清液測定其多酚含量及DPPH自由基清除能力。

(2) 超聲溫度對多酚提取率及DPPH自由基清除能力的影響：料液比1∶20(g/mL)，乙醇濃度70%，分別在30，40，50，60，70 ℃條件下超聲50 min，將提取液在4 000 r/min 下離心20 min，取上清液測其多酚含量及DPPH自由基清除能力。

(3) 超聲時間對多酚提取率及DPPH清除能力的影響：在料液比1∶20(g/mL)，乙醇濃度70%，溫度50 ℃條件下分別超聲20，30，40，50，60 min，將提取液在4 000 r/min 下離心20 min，取上清液測其多酚含量及DPPH自由基清除能力。

(4) 料液比對多酚提取率及DPPH清除能力的影響：分別以1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25(g/mL)的料液比，在乙醇濃度70%，溫度50 ℃條件下超聲50 min，將提取液在4 000 r/min下離心20 min，取上清液測其多酚含量及DPPH自由基清除能力。

1.2.5 正交試驗優(yōu)化 選取乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間、料液比為考察因素，每個因素選取3個水平，以綜合評分為指標(biāo)，用L9(34)正交表進行試驗。

1.2.6 綜合評分 以多酚含量和DPPH自由基清除率為雙指標(biāo)，將所得數(shù)據(jù)進行歸一化處理、統(tǒng)一數(shù)量級，利用綜合評分值對試驗結(jié)果進行評價[15-16]。代入式(2)計算各指標(biāo)綜合評分Yij′。

(2)

式中：

Yij′——綜合評分；

Yij——第j列的指標(biāo)數(shù)據(jù)值，%；

Yjmin——第j列中指標(biāo)最小值，0；

Yjmax——第j列中指標(biāo)最大值，100。

對兩個指標(biāo)進行加權(quán)分配，設(shè)定多酚含量和DPPH自由基清除率的權(quán)重系數(shù)分別為0.5，0.5，即多酚含量和DPPH自由基清除率的加權(quán)值Wj分別為W1=0.5，W2=0.5，將Y1、Y2代入式(2)得到Y(jié)1′、Y2′即加權(quán)綜合評分值Y=0.5Y1′+0.5Y2′。

1.2.7 米邦塔仙人掌多酚提取物抗氧化性 將仙人掌粉按照最佳提取工藝條件提取得到上清液，再將上清液經(jīng)旋蒸濃縮后干燥得到樣品，配制不同濃度的樣液進行試驗，以抗壞血酸為對照。

(1) 對羥基自由基的清除能力：根據(jù)文獻[17]的方法進行測定。

(2) 對超氧陰離子自由基的清除能力：根據(jù)文獻[18]的方法進行測定。

1.2.8 米邦塔仙人掌多酚提取物降血脂能力 將仙人掌粉按照最佳提取工藝條件提取得到上清液，再將上清液旋蒸濃縮后干燥得到樣品，配制不同濃度的樣液進行試驗。

(1) 體外膽固醇吸附能力測定：參照文獻[19]的方法修改如下，取新鮮雞蛋的蛋黃，加入9倍量的蒸餾水，攪打成乳液。分別取10 g稀釋蛋黃液于兩個200 mL的三角瓶中，并加入0.5 g樣品，調(diào)節(jié)pH至2.0和7.0，37 ℃下恒溫振蕩2 h，4 000 r/min離心20 min，吸取0.04 mL上清液，在波長550 nm條件下比色測定膽固醇含量。代入式(3)計算膽固醇的吸附量。

(3)

式中：

X——吸附量，mg/g；

A1——吸附前蛋黃膽固醇量，mg/g；

A2——吸附后蛋黃膽固醇量，mg/g；

m——樣品質(zhì)量，g。

(2) 體外膽酸鹽吸附能力測定：參照文獻[20]的方法修改如下，分別取3 mL不同濃度的樣液于100 mL三角瓶中，加入0.01 mol/L的HCl溶液1 mL，10 mg/mL胃蛋白酶(以pH 6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制) 3 mL，37 ℃下恒溫振蕩消化1 h，模擬胃環(huán)境；以0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.3，加入10 mg/mL胰蛋白酶(以pH 6.3 的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制) 4 mL，37 ℃下恒溫振蕩消化1 h，模擬腸道環(huán)境。分別加入4 mL 0.4 mmol/L甘氨膽酸鈉及4 mL 0.5 mmol/L牛磺膽酸鈉(以pH 6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制)，37 ℃下恒溫振蕩1 h后轉(zhuǎn)移至離心管中，4 000 r/min離心20 min，取上清液測定膽酸鹽含量，代入式(4)計算膽酸鹽結(jié)合率。

(4)

式中：

S——膽酸鹽結(jié)合率，%；

A1——膽酸鹽加入量，μmol；

A2——剩余量，μmol。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)分析，Origin 8.0繪圖，SPSS 19.0 進行方差分析，每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度對多酚提取率及DPPH自由基清除率的影響 由圖1可知，隨著乙醇濃度升高，多酚含量與DPPH自由基清除率不斷升高，當(dāng)濃度達到70%時多酚含量與清除率最高，之后均有所下降。嚴贊開[21]研究發(fā)現(xiàn)80%乙醇提取米邦塔仙人掌中多酚效率最高，與本研究結(jié)果相似。這是因為有一部分植物多酚以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在，乙醇濃度過高會使蛋白質(zhì)變性，影響與蛋白質(zhì)結(jié)合的多酚溶出，從而導(dǎo)致多酚提取率下降[22-23]。

圖1 乙醇濃度對多酚提取率及DPPH自由基清除率的影響

Figure 1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols and DPPH radical scavenging rate

2.1.2 超聲溫度對多酚提取率及DPPH自由基清除率的影響 由圖2可知：隨著溫度升高，多酚含量與DPPH自由基清除率不斷升高，當(dāng)溫度達到60 ℃時，多酚含量與清除率達到最高，之后均有所下降。一般溫度高有利于植物多酚的提取[24]，但高溫使超聲空化效果受到了影響，而且高溫條件下會使乙醇揮發(fā)，從而使料液比改變，影響多酚的提取[25]。

圖2 超聲溫度對多酚提取率及DPPH自由基清除率的影響

Figure 2 Effect of ultrasound temperature on extraction rate of polyphenols and DPPH radical scavenging rate

2.1.3 超聲時間對多酚提取率及DPPH自由基清除率的影響 由圖3可知，隨著時間增加，DPPH自由基清除率有所升高，當(dāng)時間達到50 min時清除率達到最高，之后清除率有所下降；多酚含量隨著時間增加不斷升高，當(dāng)時間達到40 min時達到最高點，之后多酚含量有所下降，可能是長時間超聲振動導(dǎo)致多酚結(jié)構(gòu)被破壞[26-27]。

圖3 超聲時間對多酚提取率及DPPH自由基清除率的影響

Figure 3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols and DPPH radical scavenging rate

2.1.4 料液比對多酚提取率及DPPH自由基清除率的影響 由圖4可知，隨著料液比增加，多酚含量與DPPH自由基清除率有所升高，當(dāng)料液比為1∶15(g/mL)時多酚含量與清除率達到最高，之后均逐漸下降。從節(jié)約溶劑的角度考慮，將料液比的范圍定為1∶10～1∶20 (g/mL)。

2.2 最佳提取工藝條件的確定

單因素的試驗基礎(chǔ)上，確定各因素的水平取值見表1。正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

圖4 料液比對多酚提取率及DPPH自由基清除率的影響

Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphenols and DPPH radical scavenging rate

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used for orthogonal array experiments

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 L9(34) orthogonal experimental design and results

表3 綜合評分方差分析表Table 3 Comprehensive score variance analysis table

由表2可知，以綜合評分為評價指標(biāo)時，用直觀分析法分析各因素的主次為超聲溫度>超聲時間>乙醇濃度>料液比，最佳提取方案為乙醇濃度65%，超聲溫度65 ℃，超聲時間45 min，料液比1∶15(g/mL)。由表3可知，乙醇濃度，超聲溫度和超聲時間對綜合評分影響顯著，料液比對綜合評分影響不顯著。

準(zhǔn)確稱取仙人掌粉末1 g，按照正交試驗優(yōu)化的最佳方案進行3次驗證實驗，結(jié)果提取液中多酚含量平均值為20.51 μg/mL，DPPH自由基清除率平均值為87.59%。最終得到仙人掌多酚提取物的最佳提取工藝為乙醇濃度65%，超聲溫度65 ℃，超聲時間45 min，料液比1∶15 (g/mL)。

2.3 米邦塔仙人掌多酚提取物抗氧化性

2.3.1 對羥基自由基的清除能力 由圖5可知：米邦塔仙人掌多酚提取物對羥基自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增強。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，米邦塔仙人掌多酚提取物的清除率為(93.35±0.42)%，抗壞血酸的清除率為(96.64±0.57)%，可見米邦塔仙人掌多酚提取物對羥基自由基有較強的清除能力。

圖5 米邦塔仙人掌多酚提取物對羥基自由的清除能力

Figure 5 Scavenging effect of polyphenol extract fromopuntiamilpaon hydroxyl free radicals

2.3.2 對超氧陰離子自由基的清除能力 由圖6可知：米邦塔仙人掌多酚提取物對超氧陰離子自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增強。當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，米邦塔仙人掌多酚提取物的清除率為(91.79±0.38)%，抗壞血酸的清除率為(97.65±0.73)%，可見米邦塔仙人掌多酚提取物對超氧陰離子自由基有較強的清除能力。

2.4 米邦塔仙人掌多酚提取物降血脂能力

2.4.1 體外膽固醇吸附能力 試驗結(jié)果顯示：米邦塔仙人掌多酚提取物在pH 2條件下與膽固醇的吸附能力為(10.46±0.78) mg/g，在pH 7條件下與膽固醇的吸附能力為(14.65±0.82) mg/g，與張煜等[28]對扁枝槲寄生乙醇粗提物的體外膽固醇吸附能力相比，仙人掌多酚提取物的膽固醇吸附量顯著提升。

圖6 米邦塔仙人掌多酚提取物對超氧陰離子自由基的清除能力

Figure 6 Scavenging effect of polyphenol extract fromopuntiamilpaon superoxide anion free radicals

2.4.2 體外膽酸鹽吸附能力 由圖7可知：米邦塔仙人掌多酚提取物與膽酸鹽結(jié)合能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強，當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，米邦塔仙人掌多酚提取物與甘氨膽酸鈉結(jié)合率為(34.13±0.37)%，與?；悄懰徕c結(jié)合率為(28.34±0.64)%，說明多酚提取物與甘氨膽酸鈉的結(jié)合能力更強。與夏雨等[29]對佛手果提取物的研究相比，仙人掌多酚提取物的膽酸鈉吸附能力要顯著高于佛手果提取物的膽酸鈉吸附能力，說明仙人掌多酚提取物具有較好的降血脂能力。

圖7 米邦塔仙人掌多酚提取物膽酸鹽結(jié)合能力

Figure 7 The binding capacity of polyphenol extract fromopuntiamilpaon bile salts

3 結(jié)論

試驗采用超聲波輔助法提高米邦塔仙人掌多酚得率，以多酚含量和DPPH自由基清除率為指標(biāo)，選擇料液比、乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間為單因素，并通過正交試驗進行提取條件的優(yōu)化，得到的最佳提取工藝為料液比1∶15(g/mL)，乙醇濃度65%，超聲溫度65 ℃，超聲時間45 min，在此條件下，多酚含量為20.51 μg/mL，DPPH清除率為87.59%。米邦塔仙人掌多酚提取物具有良好的抗氧化活性，在其濃度為10 mg/mL時，羥基自由基清除能力與超氧陰離子清除能力分別達到93.35%，59.83%。體外降血脂試驗結(jié)果表明米邦塔仙人掌多酚提取物在pH 2和pH 7條件下與膽固醇的吸附能力分別為10.46，14.65 mg/g；在其濃度為25 mg/mL時與甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉結(jié)合率分別為34.13%，28.34%，表明多酚提取物具有體外降血脂能力。后續(xù)將對米邦塔仙人掌提取物在體內(nèi)的抗氧化、降脂功能及其作用機理作進一步的研究與探討。