董 昕
(品測〔上?!硻z測科技有限公司,上海 201108)
VE為脂溶性維生素,包含多種生育酚和生育三烯酚。根據(jù)苯環(huán)上甲基取代基數(shù)目和位置的不同,VE分為α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚8種異構體,具有抗腫瘤、防止動脈硬化、改善心腦血管疾病、延緩衰老、增強免疫力等多種作用[1-2]。VE是人體必需的植物源維生素,人體自身無法合成,只能通過食物獲取。植物油中含有豐富的生育酚和生育三烯酚,是人類攝取VE的主要來源。不同VE異構體的生物活性不同,其中α-型的生物活性最強,δ-型的抗氧化性最強。不同品種植物油中VE組成及含量不同,其營養(yǎng)價值有很大差異。對植物油中VE各異構體的含量測定,能為消費者科學選購植物油提供參考,也能在植物油品種鑒定、摻假鑒別上提供技術參考[3]。
食品中生育酚和生育三烯酚常用的檢測方法有分光光度法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、氣相色譜法[8-9]及傅里葉變換紅外光譜法[10]等。有關8種VE同分異構體的同時快速反相液相色譜檢測技術較少,是一檢測難點。GB 5009.82—2016采用反相色譜法僅測定α-、β-、γ-、δ-生育酚4種VE;GB/T 26635—2011采用正相色譜法測定8種 VE同分異構體,但是正相高效液相色譜法有許多缺點,如流動相揮發(fā)性強、溶劑強致癌性、對儀器損耗大、重復性差、分析時間長及穩(wěn)定性差等[11-12]。反相高效液相色譜一般采用甲醇、乙腈等毒性較小、揮發(fā)性弱的溶劑作流動相,可以很好地克服正相色譜的不足。
試驗擬采用常規(guī)的甲醇和水為流動相,建立應用PFP色譜柱對植物油中8種VE異構體的超高效液相色譜分析方法。旨在更短的時間內同時檢測植物油中8種維生素異構體的含量,為植物油中VE異構體便捷穩(wěn)定的檢測提供技術支持。
1.1.1 主要儀器和設備
超高效液相色譜儀:Waters Acquity H Class 型,配熒光檢測器,美國Waters公司;
純水儀:MILLI-Q型,美國Millipore公司;
分析天平:ME204型,瑞士梅特勒—托利多公司;
旋窩振蕩器:Talboys型,美國Talboys公司。
1.1.2 試劑及耗材
α-生育酚(99.6%)、β-生育酚(96.8%)、γ-生育酚(98.2%)、δ-生育酚(97.6%)、α-生育三烯酚(98.6%)、β-生育三烯酚(97.4%)、γ-生育三烯酚(97.9%)、δ-生育三烯酚(98.3%)標準物質:德國Merk公司;
無水乙醇、異丙醇、丙酮、甲醇:色譜純,國藥集團化學試劑有限公司;
一次性注射器:5 mL,上海安譜實驗科技股份有限公司;
尼龍濾膜:0.22 μm,上海安譜實驗科技股份有限公司。
1.2.1 標準溶液的配置及標準曲線
(1) 標準儲備液:分別準確稱取VE各異構體標準品50 mg(精確到0.1 mg),用無水乙醇溶解,轉移至50 mL棕色容量瓶中定容至刻度,得到VE各異構體標準儲備液(1 000 μg/mL)。于-20 ℃以下避光儲存,使用期限不超過3個月。標準溶液使用前需進行標定。
(2) 標準中間液:從各VE異構體儲備液中取出10 mL 至100 mL棕色容量瓶中,用無水乙醇定容至刻度,得到8種VE異構體混合中間液(100 μg/mL)。
(3) 標準工作液:從8種VE異構體混合中間液(100 μg/mL)中分別準確吸取0.04,0.08,0.16,0.40,0.80,1.60,4.00 mL溶液至7個10 mL棕色容量瓶。用丙酮定容至刻度,得到濃度為0.4,0.8,1.6,4.0,8.0,16.0,40.0 μg/mL的系列標準工作液。
1.2.2 色譜條件 色譜柱:PFP柱(4.6 mm×100 mm,2.7 μm);流動相:A為甲醇,B為水;流速:0.4 mL/min;進樣量:1 μL;色譜柱溫度:30 ℃;洗脫程序:等度洗脫,甲醇∶水=93∶7(體積比);激發(fā)波長:295 nm;發(fā)射波長:330 nm。
1.2.3 樣品處理 稱取1.000 g油樣,用10 mL丙酮溶解,渦旋混合器上充分混勻后,過0.22 μm尼龍濾膜后,上機待測(渦旋過程避免丙酮蒸發(fā);整個過程中注意避光)。
(1)
式中:
Xr——樣品中VE各異構體含量,mg/kg;
m——樣品質量,g;
V——樣品定容體積,mL;
Cr——測定用樣液中VE各異構體的濃度,μg/mL。
GB 5009.82—2016是通過將油脂類樣品皂化處理,釋放出VE,通過有機溶劑萃取,濃縮,上液相色譜儀分析,處理過程較為麻煩,而且皂化過程中VE容易被氧化而損失掉,使測試結果不夠穩(wěn)定。研究將油脂樣品直接溶解于有機溶劑中,釋放出VE后直接上液相檢測。對于溶劑的選擇需滿足以下2個條件:① 脂溶性溶劑,使油脂能夠完全溶解;② 應與后續(xù)的分析方法具有匹配性[1]??扇芙庥蜆拥娜軇┯姓和?、石油醚、丙酮、異丙醇等溶劑,針對反相色譜中的后續(xù)流動相,正已烷、石油醚等與流動相不兼容,從而選擇直接用丙酮或異丙醇稀釋后上樣檢測。通過試驗發(fā)現(xiàn)丙酮溶解油脂效果優(yōu)于異丙醇且丙酮毒性相較于異丙醇更小,故選擇丙酮為提取溶劑。
生育酚和生育三烯酚的β-和γ-異構體結構相似,疏水性質差異不大,在以C18柱為固定相,乙腈—水、甲醇—乙腈、甲醇—水為流動相時,β-和γ-生育酚及生育三烯酚異構體相互重疊,不能有效分離。PFP色譜柱表面鍵合五氟苯基,有較強的幾何尺寸和立體形狀選擇性,能分離一些結構相似、用烷基固定相很難分離的位置異構體。故選擇PFP色譜柱作為分析柱。
VE在紫外檢測器和熒光檢測器上均有響應,而熒光檢測器的響應靈敏度要優(yōu)于紫外檢測的,故選擇熒光檢測器檢測。
對于流動相的選擇,研究前期嘗試了采用甲醇—水,甲醇—乙腈、乙腈—水、乙腈—二氯甲烷作做為流動相;在以甲醇—乙腈、乙腈—水、乙腈—二氯甲烷等為流動相時,α-生育三烯酚和δ-生育酚色譜峰重疊不能分開,故選甲醇—水為流動相。由于VE是脂溶性,因而流動相中的甲醇比例應盡量高,而甲醇比例太高時α-生育三烯酚和δ-生育酚兩個色譜峰也會有部分重疊;當流動相比例在甲醇∶水=93∶7(體積比),流速為0.4 mL/min(超高效色譜柱比較適用的流速)時,8個VE同分異構體能夠很好地分離(圖1),且色譜峰型,分離效果均最佳,整個分析時間在12 min左右,大大縮短了VE的分析檢測時間,提高了檢測靈敏度,由于無雜質干擾,節(jié)省了溶劑的耗費和檢測的時間及耗材成本。
圖1 8種VE異構體液相色譜圖Figure 1 8 vitamin E isomerism body fluid chromatography
8種VE異構體標準物質配置成(0.4,0.8,1.6,4.0,8.0,16.0,40.0 μg/mL)進樣,以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。以稱樣量1 g,定容體積10 mL,計算檢出限,線性方程及相關系數(shù)詳見表1。由表1可知:該方法各VE異構體在0.4~40.0 μg/mL范圍內線性關系良好,相關系數(shù)在0.999 174~0.999 870。
對大豆油樣品各VE異構體分別添加3個濃度水平(4,8,20 mg/kg),每個水平進行6次試驗,得到樣品中8種VE異構體的回收率及相對標準偏差,詳見表2。由表2可知:各個濃度水平的添加回收率均在90%以上,精密度為0.28%~1.22%。
表1 8種VE異構體的線性方程和相關系數(shù)Table 1 Linear equation and correlation coefficient for the 8 isomerans of vitamin E
表2 大豆油中8種VE異構體樣品添加回收率和精密度Table 2 Recovery rate and precision of 8 vitamin E isomers in soybean oil samples
各VE異構體保留時間和相互之間分離度見表3、4。
表3 8種VE異構體出峰順序、保留時間、基線寬度Table 3 Peak order, retention time, baseline width of 8 vitamin E isomers
表4 各異構體之間分離度Table 4 Separability between isomers
由表3、4可知:8種VE異構體能夠完全分離。
從市面上隨機選取15種不同品種的植物油,采用本研究的檢測方法檢測其VE中的異構體構成,檢測結果見表5。
表5 植物油中VE含量Table 5 Vitamin E content in vegetable oils mg/kg
通過對植物油樣品檢測前處理的優(yōu)化,采用丙酮溶解樣品后上樣,在優(yōu)化的色譜條件下,PFP色譜柱超高效液相色譜法能很好地將8種VE異構體分離開,測定結果準確,測試流程簡單。相較于皂化法處理油樣,丙酮直接溶解提取法檢測VE損失更少,結果更準確;相較于正相色譜分離,分析時間更短,重現(xiàn)性更好。采用該方法檢測了15種常用植物油中VE各異構體的含量,滿足實際樣品分析的需求。