日本龜蠟蚧腸道微生物多樣性分析

郝文英，張艷峰，謝映平

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

日本龜蠟蚧（Ceroplastes japonicus Green）屬半翅目蚧科蠟蚧屬，在我國分布范圍廣泛，危害多種林木和果樹，是一種種群聚集性的害蟲。在昆蟲的整個生命過程中，腸道微生物是影響其生長發(fā)育和新陳代謝的重要元素之一[1-3]。按腸道微生物與宿主昆蟲間的利弊關(guān)系可以分為益生菌、病原菌、條件致病菌[4]。刺吸式昆蟲靠吸食植物韌皮部汁液存活，但研究表明，植物汁液中的營養(yǎng)物質(zhì)單一且不均衡缺少昆蟲生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)[5]。DOUGLAS[6-7]利用抗生素和含同位素的營養(yǎng)液飼喂的方法研究證明，Buchnera 可以為宿主蚜蟲提供多種必需氨基酸。ZAKEE 等[8-9]通過對Uzinura 的基因組分析表明，腸道微生物Uzinura 可以為盾蚧提供必需氨基酸。

本試驗利用高通量測序技術(shù)對日本龜蠟蚧腸道細菌的16S rDNA 序列進行測序分析，得到日本龜蠟蚧腸道的優(yōu)勢菌群，通過抗生素處理腸道菌群結(jié)構(gòu)預(yù)測腸道微生物對宿主營養(yǎng)代謝的影響，旨在為日本龜臘蚧綜合控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

蚧蟲于2018 年4 月采自稷山縣日本龜蠟蚧發(fā)生嚴重的柿樹和棗樹上，采樣時將日本龜蠟蚧寄生的樹枝一同剪下帶回實驗室短期飼養(yǎng)，4 ℃保存。

1.2 試劑及儀器

1.3 試驗方法

1.3.1 腸道微生物多樣性分析 在無菌環(huán)境下，將日本龜蠟蚧的蠟殼剝離收集，反復(fù)漂洗后在顯微解剖鏡下解剖出消化道，置于1.5 mL 離心管中。切碎消化道組織，按照DNeasyRBlood&Tissue Kit 試劑盒提取腸道總DNA。在Thermo NANODROP 2000中檢測質(zhì)量濃度為5～20 μg/μL，于-80 ℃冰箱中保存寄樣。

1.3.2 抗生素處理 用電子天平稱取卡那霉素、氨芐青霉素、利福平各15 mg，分別溶于無菌水中，按1∶1∶1 的比例混合，制成復(fù)合抗生素溶液。將帶有日本龜蠟蚧的樹枝浸泡在復(fù)合抗生素溶液中，定期地在葉子上噴灑抗生素溶液，對照組噴灑無菌水，重復(fù)3 次。

1.3.3 共生菌多樣性分析 基于Illumina HiSeq 測序平臺，利用雙末端測序的方法，通過構(gòu)建小片段文庫來測序。通過對Reads 拼接過濾，OTUs 聚類，可以揭示樣品的物種構(gòu)成；16S 功能基因預(yù)測分析是使用PICRUSt 軟件通過比對16S 測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，得到不同分組之間的功能差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU 分析

OTU 即分類操作單元，結(jié)合OTU 所代表的物種根據(jù)不同的分組繪制Venn 圖，表示樣品之間共有和特有的OTU 數(shù)目[10]。圖1 中不同顏色代表不同樣本，橢圓形之間重合部分的數(shù)字為樣品之間共有的OTU 個數(shù)。日本龜臘蚧在同一齡期不同寄主下處理前后共有菌為319 種，其中，柿樹對照組特有菌為401 種，柿樹處理組特有菌為365 種；棗樹對照組特有菌為448 種，棗樹處理組特有菌為381 種。

2.2 物種豐度比例分析

分別從門、綱、目、科、屬水平探究不同寄主以及經(jīng)抗生素處理后細菌豐度的變化。門水平各組樣品中，日本龜蠟蚧腸道微生物中優(yōu)勢菌為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes），共占到總菌門數(shù)的80%以上；綱水平各組樣品中，日本龜蠟蚧腸道微生物優(yōu)勢菌綱為梭菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、γ- 變形菌綱（Gammaproteobacteria）、α- 變形菌綱（Alphaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli），共占到總菌綱數(shù)的69%～70%；目水平各樣品中，日本龜蠟蚧腸道微生物優(yōu)勢菌目為梭菌目（Clostridiales）和擬桿菌目（Bacteroidales），共占到總菌目數(shù)的33%～35%；科水平各樣品中，日本龜蠟蚧腸道微生物優(yōu)勢菌科為擬桿菌科（Bacteroidaceae）、韋榮氏球菌科（Veillonellaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae），共占到總菌科數(shù)的33%～36%。

在屬水平上，寄主為棗樹和柿樹的日本龜蠟蚧腸道微生物優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬（Bacteroides）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）。用抗生素處理后，寄主為棗樹的日本龜蠟蚧腸道微生物中優(yōu)勢菌沒有明顯變化；寄主為柿樹的日本龜蠟蚧腸道微生物優(yōu)勢菌擬桿菌屬由15.07%下降至10.08%、韋榮氏球菌屬由10.32%下降至5.61%、布赫納氏菌屬由0.16%上升至0.21%（表1）。

表1 屬水平日本龜蠟蚧主要共生菌所占比例 %

2.3 16S 功能基因預(yù)測分析

KEGG 功能預(yù)測是通過KEGG 代謝途徑的差異分析，觀測不同分組的樣品之間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化，是研究群落樣本為適應(yīng)環(huán)境變化發(fā)生代謝功能改變的有效手段。

日本龜蠟蚧經(jīng)抗生素處理后，其糖類代謝、甘氨酸生物合成和代謝及脂類代謝均顯著下降，表明腸道菌群能夠促進動物營養(yǎng)的代謝和吸收。

3 結(jié)論與討論

本試驗通過高通量測序分析細菌16S rDNA 可變區(qū)，得出日本龜蠟蚧腸道微生物的優(yōu)勢菌群，以及經(jīng)抗生素處理后日本龜蠟蚧腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化，從而推測腸道微生物與代謝途徑的關(guān)系。有研究表明，昆蟲內(nèi)腸道微生物參與了宿主大多數(shù)的生命活動，對宿主的適應(yīng)性有很大作用[11-12]；腸道內(nèi)微生物還能為宿主提供食物中缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)并參與能量代謝等，間接提高宿主的防御能力[13-14]。LIANG 等[15]研究表明，在家蠶的幼蟲體內(nèi)，變形菌門和擬桿菌門屬于優(yōu)勢菌群，分別占總菌門數(shù)的31%和40%。在日本龜蠟蚧中優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，經(jīng)抗生素處理后，優(yōu)勢菌門種類沒有明顯發(fā)生變化。

日本龜蠟蚧優(yōu)勢菌綱為擬桿菌綱、梭菌綱、α-變形菌綱和γ- 變形菌綱。HONGOH 等[16]研究表明，生活在土壤中的蠐螬，其腸道優(yōu)勢菌群也為梭菌綱（Clostridia）。研究表明，α- 變形菌綱中的沃爾巴克氏菌在腸道微生物中占有很大的比例，沃爾巴克氏體參與了昆蟲生殖調(diào)控過程[17-19]。HONGOH 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，白蟻中有一種Bacteroides 屬的細菌共生體CfPT1-2，該共生菌含有合成氨基酸和輔酶因子的功能基因。本研究表明，日本龜蠟蚧腸道微生物處理組與對照組的擬桿菌屬豐度也存在顯著差異，而在16S 功能基因分析中發(fā)現(xiàn)，輔因子代謝在處理前后有顯著變化。因此，推測擬桿菌屬參與了棗樹日本龜蠟蚧輔因子的代謝途徑。

綜上分析，經(jīng)過多樣性檢測及KEGG 功能預(yù)測，營養(yǎng)代謝的變化可能與對照組中的特有菌有關(guān)，其具體參與過程有待進一步研究，研究結(jié)果對日本龜蠟蚧的防治具有一定的參考意義。