基于高通量測(cè)序技術(shù)的玉米不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌多樣性變化

李 丹，靳鯤鵬，李小霞，韓文清，曹晉軍，劉永忠，李萬星

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所，山西長(zhǎng)治046011）

土壤微生物的種類繁多、數(shù)量龐大，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[1-3]。土壤細(xì)菌通過參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)合成和養(yǎng)分循環(huán)等物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)過程，從而影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育[4-6]。結(jié)構(gòu)合理、循環(huán)良好的土壤生態(tài)系統(tǒng)是保證玉米高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的前提，而關(guān)于玉米生長(zhǎng)過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的研究較少。

傳統(tǒng)研究土壤微生物的方法存在一定的局限性，如平板計(jì)數(shù)法就忽略了不可培養(yǎng)微生物、擴(kuò)大了生長(zhǎng)速度等問題，使得研究微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)成為一個(gè)難題。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，其憑借耗時(shí)少、通量高、能較為準(zhǔn)確地反映微生物在土壤中的群落分布等優(yōu)勢(shì)，使微生物研究更為深入[7]。

本試驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定玉米4 個(gè)關(guān)鍵生育時(shí)期細(xì)菌的多樣性，從而了解玉米不同生長(zhǎng)期細(xì)菌的群落特點(diǎn)及變化規(guī)律，旨在為玉米高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)創(chuàng)造健康的土壤環(huán)境，為后續(xù)的科學(xué)施肥、土壤質(zhì)量的評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所內(nèi)試驗(yàn)田。該試驗(yàn)田土壤類型為壤土，前茬作物為玉米。

1.2 試驗(yàn)材料采集

于玉米苗期（SG1）、大口期（SG2）、抽雄期（SG3）和成熟期（SG4）隨機(jī)采集0～20 cm 表層土壤，每個(gè)時(shí)期取10 個(gè)點(diǎn)混合，混合均勻后過2 mm篩，處理好的樣品分成2 份，一份寄送到北京百邁克生物科技有限公司（http：//www.biomarker.com.cn/）進(jìn)行微生物多樣性測(cè)序；另一份包入無菌錫箔紙放入液氮中速凍，隨后帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

委托北京百邁客生物科技有限公司對(duì)土壤樣品進(jìn)行總DNA 的提取、純化并構(gòu)建玉米不同生育期土壤細(xì)菌的cDNA 文庫(kù)；然后利用雙端測(cè)序的方法對(duì)土壤細(xì)菌的16S rRNA V3＋V4 區(qū)進(jìn)行Illumina（Hiseq 2500 高通量測(cè)序技術(shù)）測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

使用FLASH v1.2.7、Trimmomatic v0.33、UCHIME v4.2 等軟件，對(duì)每個(gè)樣品的原始序列進(jìn)行拼接、過濾以及去除嵌合體，最終得到有效數(shù)據(jù)。

使用QIIME[8]（version 1.8.0）軟件中的UCLUST[9]對(duì)Tags 在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得OTU；并基于Silva（細(xì)菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU 進(jìn)行分類學(xué)注釋，并統(tǒng)計(jì)各生育時(shí)期的群落組成。

使用Mothur 1.30 軟件對(duì)細(xì)菌多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序與序列組裝

經(jīng)Illumina 測(cè)序，共獲得640 139 條測(cè)序片段，通過雙端拼接、過濾后，共產(chǎn)生496 774 條有效序列。在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類分析，結(jié)果共獲得3 976 個(gè)OTU。稀釋曲線（Rarefaction curve）是用來驗(yàn)證各樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量是否充分以及數(shù)據(jù)量是否能夠反映樣品中的多樣性。本試驗(yàn)4 組樣品的稀釋曲線均逐漸趨于平緩（圖1），說明樣品基本合理，能夠較真實(shí)地反映土壤樣本中的細(xì)菌群落。

2.2 不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性（Alpha diversity）有多種衡量指標(biāo)，即Chao1 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)，能夠反映單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性。其中，Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)是衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少；Shannon 和Simpson 指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響，Shannon 指數(shù)越大，Simpson 指數(shù)越小，說明樣品的物種多樣性越高[10]。覆蓋率越高，表明樣本中物種被測(cè)出的概率越高，而沒有被測(cè)出的概率越低。

表1 不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)比較

隨著玉米生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)程，細(xì)菌的豐度和多樣性隨之變化。細(xì)菌豐度表現(xiàn)為SG3＞SG1＞SG2＞SG4，多樣性表現(xiàn)為SG1＞SG2＞SG3＞SG4。SG4 時(shí)期細(xì)菌Ace 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)均最小，Simpson 指數(shù)最大，說明在收獲期土壤豐度最低，多樣性最小；SG3 時(shí)期細(xì)菌Ace、Chao1 指數(shù)均最大，說明在抽雄期土壤豐度最大；SG1 時(shí)期Simpson指數(shù)最小，Shannon 最大，說明在苗期多樣性最大（表1）。

2.3 不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落組成分析

將OTU 所代表的序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在各水平統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成。在玉米不同生育時(shí)期的土壤中分別檢測(cè)到42，37，39，37 個(gè)細(xì)菌門，128，119，126，120 個(gè)細(xì)菌綱，333，312，331，310 個(gè)細(xì)菌科和514，487，510，478 個(gè)細(xì)菌屬。

創(chuàng)新律師顧問服務(wù)形式。泰安市人大常委會(huì)共組建1個(gè)律師顧問團(tuán)和8個(gè)律師顧問小組。律師顧問團(tuán)由5名律師組成，為市人代會(huì)會(huì)議期間代表履職提供駐會(huì)法律服務(wù)。組建的8個(gè)律師顧問小組分別為全國(guó)人大代表、省人大代表和6個(gè)縣（市、區(qū)）人大代表履職服務(wù)律師顧問小組，每個(gè)團(tuán)組設(shè)兩名聯(lián)系人員，分別由市縣兩級(jí)人大常委會(huì)和司法行政機(jī)關(guān)工作人員擔(dān)任。人大代表需要法律服務(wù)時(shí)，可以從公布的律師顧問小組中自由選取律師，也可以通過聯(lián)系人隨機(jī)選取律師。常委會(huì)明確了律師顧問服務(wù)的性質(zhì)和服務(wù)期限，服務(wù)屬于公益性活動(dòng)，不收取任何費(fèi)用；服務(wù)期限與人大代表任職期限相同。

門分類水平下，玉米不同生育時(shí)期的土壤中檢測(cè)到的細(xì)菌門數(shù)分別為42，37，39，37 個(gè)。其中，豐度排名較高的前10 個(gè)門分別為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bcateroidetes）、芽單胞桿菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和螺旋體菌門（Saccharibacteria）（圖2）。

在玉米4 個(gè)關(guān)鍵生育時(shí)期的土壤中，變形菌門是該土壤微生物的優(yōu)勢(shì)類群，約占所發(fā)現(xiàn)微生物總數(shù)的31%，其次依次是酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、芽單胞桿菌門，其余4 個(gè)門豐度較低，均小于5%。

屬分類水平下，玉米不同生育時(shí)期的土壤中檢測(cè)到的細(xì)菌綱數(shù)分別為128，119，126，120 個(gè)。其中，豐度排名較高的前10 個(gè)屬的種類分別是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonadaceae）、芽單胞桿菌屬（Gemmatimonadaceae）、Subgroup-6、H16、噬纖維細(xì)菌屬（Cytophagaceae）、黃單胞菌屬（Xanthomonadales）、厭氧繩菌屬（Anaerolineaceae）、Gaiellales、RB41（圖3）；未知種類細(xì)菌占據(jù)很大比例。

通過Python 語(yǔ)言工具對(duì)樣品進(jìn)行層次聚類（圖4-A），用于判斷各樣品間物種組成的相似性；各樣品屬水平的豐度柱狀圖（圖4-B），用以判斷各樣品間物種豐度的相似性。2 個(gè)樣品越靠近，枝長(zhǎng)越短，說明2 個(gè)樣品的物種組成越相似。4 個(gè)樣品中，SG1和SG3 距離最近，說明這2 個(gè)時(shí)期的土壤中微生物的組成最相似，與SG4 的距離最遠(yuǎn)，說明SG4 與其他樣品組成差異最大。

3 結(jié)論與討論

門分類水平下，4 個(gè)樣品中變形菌門是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，其次是酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和芽單胞桿菌門。這與前人研究結(jié)果一致。JANGID 等[11]在不同類型的耕作土壤中發(fā)現(xiàn)，變形菌門占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。袁紅朝等[12]對(duì)稻田的土壤細(xì)菌進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門是稻田的土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。其次是放線菌門。劉欣等[13]對(duì)大豆不同生育期根際土壤細(xì)菌群落研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門、放線菌門、酸桿菌門是大豆根際的優(yōu)勢(shì)菌門，但是綠彎菌門含量較少。而本研究中，綠彎菌門含量較多，且其余菌群比例與在以往研究中菌群比例也不相同，這可能與植物的種類、所處地理因素引起的多樣性、與植物的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系等因素有關(guān)。其中，酸桿菌可降解植物病殘?bào)w多聚物，參與鐵循環(huán)，具有光合和反硝化能力[14]，對(duì)穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用[15-16]；放線菌可參與土壤結(jié)構(gòu)的形成，土壤中有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化，植物生長(zhǎng)素和抗生素的分泌[17]；綠彎菌是活性污泥的組成成分之一[18]，有利于降解土壤中的有毒物質(zhì)，在營(yíng)養(yǎng)較低環(huán)境中適宜生長(zhǎng)[19]；硝化螺旋菌作為硝化作用第一階段的細(xì)菌，可將氨氧轉(zhuǎn)化成亞硝酸。單胞菌門適合在環(huán)境干燥的土壤中生存[20]；變形菌門、浮霉菌門、放線菌門和硝化螺旋菌門喜好營(yíng)養(yǎng)豐富的土壤環(huán)境；還有絕大多數(shù)細(xì)菌未能進(jìn)行分類、培養(yǎng)，其生物學(xué)功能不明確，后續(xù)需加強(qiáng)對(duì)其研究。

在玉米的整個(gè)生育期進(jìn)程中，土壤中細(xì)菌多樣性隨著時(shí)間的變化而變化。細(xì)菌豐度由大到小排序?yàn)镾G3＞SG1＞SG2＞SG4，多樣性由大到小為SG1＞SG2＞SG3＞SG4。細(xì)菌豐度在抽雄期最大，其次依次是苗期、大口期，最后是成熟期。細(xì)菌多樣性在苗期最大，然后依次遞減，在成熟期最小。說明在玉米發(fā)育過程中，隨著溫度、水分、營(yíng)養(yǎng)等因素的變化，一些適應(yīng)環(huán)境的細(xì)菌數(shù)量增加，不適應(yīng)環(huán)境的細(xì)菌數(shù)量在減少。在苗期，溫度適宜，土壤營(yíng)養(yǎng)最為豐富，使得細(xì)菌多樣性最大；在成熟期，溫度降低，營(yíng)養(yǎng)減少，使得土壤細(xì)菌多樣性與豐度最低；在大口期，適宜生長(zhǎng)的細(xì)菌大量繁殖，使得豐度上升。

本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)探究玉米4 個(gè)不同關(guān)鍵生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，通過分析4 個(gè)不同生育時(shí)期的土壤可知，苗期多樣性指數(shù)最高，成熟期最低，表明玉米的生育時(shí)期對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定影響。本研究為更深入了解玉米細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及群落結(jié)構(gòu)的變化提供了理論依據(jù)。