馬鈴薯莖尖脫毒新方法探析

左靜靜，閆貴云，霍利光，左 敏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西太原030031）

馬鈴薯是一種糧、菜、飼、工業(yè)原料兼用型經(jīng)濟(jì)作物，產(chǎn)量高，營養(yǎng)豐富，適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣[1-2]。2015 年1 月，農(nóng)業(yè)部制定的《2015 年種植業(yè)工作要點》已經(jīng)把馬鈴薯列為重點，今后馬鈴薯將逐漸成為我國第四大主要糧食作物[3]。馬鈴薯生產(chǎn)中，存在的病毒和類病毒共有十幾種[4]，在我國馬鈴薯產(chǎn)區(qū)普遍存在馬鈴薯X 病毒（PVX）、馬鈴薯A 病毒（PVA）、馬鈴薯Y 病毒（PVY）、馬鈴薯S 病毒（PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）以及馬鈴薯紡錘狀塊莖類病毒（PSTVd）[5-7]。這些病毒和類病毒使馬鈴薯品種退化，在馬鈴薯的連年種植過程中，產(chǎn)量和品質(zhì)逐年下降，而解決退化的有效措施就是生產(chǎn)脫毒種薯，然而馬鈴薯脫毒苗莖尖分生組織體積約為0.5 mm，因此，在其脫毒中成苗率低，畸形化嚴(yán)重[8]。

當(dāng)前脫毒馬鈴薯脫毒種薯主要使用的脫毒方法為：選取塊莖、植株芽條或者帶病毒試管苗結(jié)合熱處理常規(guī)消毒處理，在無菌條件中解剖鏡下剝離分生組織，培養(yǎng)、成苗、擴(kuò)繁、病毒及類病毒檢測，經(jīng)遺傳穩(wěn)定性鑒定后工廠化快速繁殖使用[9-12]。該技術(shù)是目前馬鈴薯莖尖脫毒的一般程序，但存在的不足之處有：脫毒周期長、環(huán)節(jié)多，需要經(jīng)過熱處理使病毒鈍化[13]，莖尖剝離以后需進(jìn)行愈傷及成苗培養(yǎng)，獲得脫毒苗以后還需要進(jìn)行穩(wěn)定性鑒定[14]。它對技術(shù)和設(shè)備要求高，需要解剖鏡，莖尖剝離的操作很細(xì)致，莖尖不能過大或過小，過大脫毒率低，過小不易成活[15-17]。此外，莖尖剝離后在愈傷培養(yǎng)時會在培養(yǎng)基內(nèi)加一些激素，分生組織受這些激素影響可能會產(chǎn)生遺傳變異，并且馬鈴薯莖尖細(xì)胞非常小，存在遺傳物質(zhì)不完整的風(fēng)險。

目前，也有部分學(xué)者通過將需要脫毒的原原種進(jìn)行田間播種，在現(xiàn)蕾或開花期從馬鈴薯地里篩選健康的植株，做好標(biāo)記，較其他植株提前15 d 收獲[18-19]。每株篩選個大、薯型標(biāo)準(zhǔn)和健康的種薯單獨收獲和貯存；種薯發(fā)芽后，剪取幼芽進(jìn)行病毒檢測[20]；將檢測健康的種薯重新催芽后，剪取大芽經(jīng)酒精和升汞殺菌處理后，放于常規(guī)MS 固體培養(yǎng)基上做成莖段苗；將長高的莖段苗剪取上部1/3 高度保種，剩余2/3 進(jìn)行病毒檢測；病毒檢測合格后，按照常規(guī)方法進(jìn)行快繁。該技術(shù)病毒檢測合格率低，制苗效率低且成本較高[21-22]。

本試驗針對目前馬鈴薯莖尖脫毒方法中存在的這些問題，結(jié)合多年研究和實踐操作經(jīng)驗，總結(jié)出了一套高效且保證品質(zhì)的馬鈴薯莖尖脫毒新方法。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯品種為晉薯16 號、克新1 號、冀張北12 號、農(nóng)家種，其中，晉薯16 號為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所審定品種，克新1 號為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院審定品種，冀張北12 號為河北省張家口農(nóng)業(yè)科學(xué)院審定品種，農(nóng)家種為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民自繁自種品種。

1.2 試驗方法

（1）將需要脫毒的馬鈴薯塊莖埋于土壤中，置于四周遮光、頂部透光環(huán)境中催芽，發(fā)芽后在20～25 ℃下進(jìn)行拔高培養(yǎng)。（2）待催生的芽長到50～80 cm 時，在最高的莖上剪取0.8～1.0 cm 的莖尖，用洗潔精水浸泡后洗凈，然后清水中浸泡后沖洗干凈，接著用75%酒精表面消毒30 s，然后用0.05%升汞滅菌10 min，無菌水沖洗4～5 次，接種于MS培養(yǎng)基上，pH 值5.8～6.4，培養(yǎng)莖尖苗。（3）莖尖苗在溫度25～28 ℃、光照強(qiáng)度2 200～2 500 lx 下每天光照12 h 進(jìn)行培養(yǎng)。（4）待莖尖苗長高到7～8 cm時，在超凈臺上剪取0.2 mm 的莖尖（以肉眼可見為準(zhǔn)），置于培養(yǎng)基中按步驟（3）的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。（5）重復(fù)步驟（4）4～5 次后剪取莖尖保種，剩余莖段進(jìn)行病毒檢測。（6）病毒檢測合格后，脫毒完成。

病毒檢測由農(nóng)業(yè)部脫毒馬鈴薯種薯質(zhì)量監(jiān)督檢測測試中心進(jìn)行。所用主要儀器是酶標(biāo)儀和雜交箱。檢測標(biāo)準(zhǔn)為NY/T401—2000，NY/T2744—2015。

2 結(jié)果與分析

4 個供試品種晉薯16 號、克新1 號、冀張北12號、農(nóng)家種脫毒之后，依次編號2017-W-161、2017-W-162、2017-W-163、2017-W-164 進(jìn)行馬鈴薯病毒檢測，每個樣本檢測馬鈴薯6 種病毒（PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV）和1 種類病毒（PSTVd）。馬鈴薯種薯質(zhì)量監(jiān)督檢測測試中心的檢測結(jié)果列于表1。在所檢測的樣品中樣本2017-W-161 攜帶病毒PVX 和PVY；樣本2017- W-162 攜帶病毒PVY 和類病毒PSTVd；樣本2017-W-163 攜帶病毒PVA 和類病毒PSTVd；樣本2017-W-164 攜帶病毒PVX、PVA 和類病毒PSTVd。經(jīng)本研究方法的脫毒之后，檢測4 個樣本中均不含以上6 種病毒和1 種類病毒。

表1 4 個馬鈴薯樣本的病毒檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，根尖和芽尖的分生組織含病毒量少或不含病毒。病毒復(fù)制須利用寄主的代謝過程，而分生組織缺乏真正的維管組織，當(dāng)遇到分生組織旺盛的新陳代謝活動時，病毒的復(fù)制無法與分生組織旺盛的代謝活動競爭，大多數(shù)病毒在植株內(nèi)通過韌皮部進(jìn)行遷移，或在細(xì)胞間通過胞間連絲傳輸，因為細(xì)胞與細(xì)胞間的移動速度較慢，在快速分裂的組織中病毒濃度高峰被推遲，以及分生組織的生長素濃度通常很高，可能影響病毒的復(fù)制，因此，在新生長出的芽端極小的范圍內(nèi)，病毒的含量幾乎為零。

試驗結(jié)果表明，本研究方法解決了現(xiàn)有馬鈴薯莖尖脫毒存在脫毒周期長、脫毒苗易發(fā)生變異、制苗成本高且病毒檢測合格率低的問題，提供了一種馬鈴薯莖尖的重復(fù)培養(yǎng)脫毒方法。其大大簡化了脫毒的步驟，不需要經(jīng)過熱處理操作，簡化了莖尖剝離的步驟，撇開了解剖鏡下的細(xì)微操作，避免了因莖尖過小而丟失遺傳物質(zhì)的問題；而且莖尖剝離后的培養(yǎng)不添加激素，大大降低了產(chǎn)生遺傳變異的概率；同時拔高培養(yǎng)及莖尖苗培養(yǎng)參數(shù)的選取是通過大量反復(fù)試驗得出的。

本研究表明，馬鈴薯X 病毒（PVX）、Y 病毒（PVY）、A 病毒（PVA）和類病毒（PSTVd）可以用以下高效的脫毒方法：選取薯塊拔高培養(yǎng)，待芽長到50～80 cm 時，剪取最高的0.8～1.0 cm 的莖尖，75%酒精消毒30 s，0.05%氯化汞消毒10 min，置于MS 培養(yǎng)基中，在溫度25～28 ℃、光照強(qiáng)度2 200～2 500 lx 下每天光照12 h 進(jìn)行培養(yǎng)；待莖尖苗長到7～8 cm 時，在超凈臺上剪取0.2 mm 的莖尖（以肉眼可見為準(zhǔn)），置于MS 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件不變，重復(fù)培養(yǎng)4～5 次后剪取莖尖保種，剩余莖段進(jìn)行病毒檢測，脫毒完成。