熱休克轉(zhuǎn)錄因子1在AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用*

劉 瑋, 宗佩君， 劉珊珊

(1濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院病理教研室， 山東 青州 262500； 2濰坊市益都中心醫(yī)院病理科， 山東 濰坊 261000)

動(dòng)脈粥樣硬化是一種涉及腦動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈等血管組織損傷的病理過程，其可以誘發(fā)血管管壁破裂、管腔閉塞等導(dǎo)致心肌梗死和中風(fēng)等疾病的發(fā)生，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生于動(dòng)脈粥樣硬化的早期，血管內(nèi)皮細(xì)胞過度凋亡是造成血管組織正常功能缺失的重要原因，另外，血管內(nèi)皮細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化過程中分泌大量的炎癥因子，這些炎癥因子可以刺激正常的組織和細(xì)胞，加快動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[1-3]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock tran-scription factor 1，HSF1)是存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的HSF亞型，其是調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其不僅參與熱休克反應(yīng)，還參與組織發(fā)育和生殖等過程，HSF1具有抗炎、抗凋亡等作用，HSF1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中代償性的高表達(dá)，HSF1具有降低氧化應(yīng)激條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，在內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，對(duì)于HSF1在血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用尚不明確[4]。本實(shí)驗(yàn)通過上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中HSF1的表達(dá)水平，探討HSF1在AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用，為明確HSF1在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC-2購(gòu)自ATCC?？笻SF1抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑盒和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscience；pcDNA3.1-HSF1由廣州輝駿生物科技有限公司構(gòu)建；抗CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologus protein，CHOP)抗體、抗cleaved caspase-3抗體和抗活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)抗體購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司；一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測(cè)試劑盒、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)含量檢測(cè)試劑盒和內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1) 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche；AngⅡ購(gòu)自Sigma。

2 方法

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM中。血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1，記為pcDNA3.1組和pcDNA3.1-HSF1組；用含有10-5mol/L的AngⅡ細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1的血管內(nèi)皮細(xì)胞，記為pcDNA3.1+AngⅡ組和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ組；用含有10-5mol/L的AngⅡ細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)未做轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮細(xì)胞記為AngⅡ組；把0 mol/L的AngⅡ細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的未做轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮細(xì)胞記為對(duì)照(control)組。各組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1轉(zhuǎn)染方法同Lipofectamine2000，用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2過表達(dá)效果的檢測(cè) RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平：control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1各組細(xì)胞按照細(xì)胞RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，按照SYBR RT-qPCR試劑盒進(jìn)行PCR，HSF1的上游引物序列為5′-GGAAAGCTGTCCGCTGATGG-3′， 下游引物序列為5′-GCTGGAGATGGAGCTGAGTA-3′。β-actin的上游引物序列為5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′， 下游引物序列為5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。結(jié)果按照2-ΔΔCt法計(jì)算，以β-actin作為內(nèi)參照。

Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1各組細(xì)胞用含有PMSF的RIPA裂解液提取蛋白以后，經(jīng)BCA法對(duì)蛋白樣品定量，進(jìn)行SDS-PAGE，每個(gè)泳道添加20 μg蛋白樣品，在濃縮膠中的電壓為100 V，觀察染料到達(dá)分離膠和濃縮膠的交接處，把電壓調(diào)整到120 V，觀察染料進(jìn)入底部邊緣，停止電泳。進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電壓設(shè)置為90 V，轉(zhuǎn)膜80 min后，把NC膜取出，經(jīng)5%牛血清白蛋白室溫封閉以后，與抗HSF1和內(nèi)參照β-actin的抗體反應(yīng)后，與HRP標(biāo)記的 II 抗反應(yīng)，經(jīng)ECL法顯色后，根據(jù)灰度值分析HSF1表達(dá)水平?？笻SF1的抗體稀釋倍數(shù)為1∶400，抗β-actin抗體的稀釋倍數(shù)為1 ∶1 000。

2.3LDH、NO和ET-1分泌水平的檢測(cè) 將control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后，收集培養(yǎng)液上清，分別檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH(二硝基苯肼法)、NO(硝酸還原酶法)和ET-1(ELISA法)水平，步驟均同試劑盒說明書。

2.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 將control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后，收集細(xì)胞，以500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮后，添加PI和annexin V-FITC染液，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡變化。

2.5細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β水平的檢測(cè) 將control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，步驟同試劑盒操作說明。

2.6細(xì)胞中CHOP、ATF6和cleaved caspase-3蛋白水平檢測(cè) 將control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h以后，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中CHOP、ATF6和cleaved caspase-3的蛋白水平，步驟同2.2。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 pcDNA3.1-HSF1提高血管內(nèi)皮細(xì)胞中HSF1的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HSF1能夠明顯提高血管內(nèi)皮細(xì)胞中HSF1的mRNA和蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of HSF1 at mRNA and protein levels in transfected vascular endothelial cells. A: the mRNA expression of HSF1 was detected by RT-qPCR; B: the protein expression of HSF1 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1 group and control group.

圖1 HSF1在轉(zhuǎn)染后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)

2 過表達(dá)HSF1減少AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌LDH

AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的LDH增多；過表達(dá)HSF1后的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，細(xì)胞分泌的LDH減少(P<0.05)，見表1。HSF1具有降低AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。

3 HSF1對(duì)AngⅡ處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO和ET-1水平的影響

AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO含量降低，ET-1含量升高;高表達(dá)HSF1后的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，細(xì)胞分泌的NO含量升高，ET-1含量降低(P<0.05),見表1。HSF1具有改善AngⅡ處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管活性物質(zhì)的作用。

表1 過表達(dá)HSF1的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌LDH、NO 與ET-1水平的比較

Table 1.The effects of HSF1 over-expression on the secretion of LDH, NO and ET-1 in vascular endothelial cells induced by Ang II (Mean±SD.n=3)

GroupLDH (U/L)NO (μmol/L)ET-1 (ng/L) Control81.45±8.320.47±0.0650.41±6.32 AngⅡ225.48±17.26*0.20±0.02*95.26±7.51* pcDNA3.1+AngⅡ217.40±22.810.19±0.0394.20±8.32 pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ125.87±10.95&0.36±0.03&75.36±6.20&

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

4 過表達(dá)HSF1降低AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平

AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平升高；過表達(dá)HSF1后的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，見圖2。HSF1可降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡水平。

Figure 2. The effects of HSF1 over-expression on the apoptosis of vascular endothelial cells induced by Ang II. A: the results of flow cytometry for analyzing the effect of HSF1 over-expression on Ang II-induced apoptosis of vascular endothelial cells; B: the results of Western blot for determining the effects of HSF1 over-expression on the protein level of cleaved caspase-3 in vascular endothelial cells induced by Ang II. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

圖2 過表達(dá)HSF1的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后細(xì)胞的凋亡情況

5 過表達(dá)HSF1減少AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β

AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β增多；過表達(dá)HSF1后的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β減少(P<0.05)，見表2。HSF1具有降低AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎癥因子的作用。

表2 過表達(dá)HSF1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響

Table 2.The effects of HSF1 over-expression on the levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β secreted by vascular endothelial cells after Ang II induction (Mean±SD.n=3)

GroupTNF-α (ng/L)IL-6 (ng/L)IL-1β (ng/L) Control332.47±25.159.82±0.961 542.69±158.20 AngⅡ528.14±62.85*35.20±3.59*2 178.63±163.18* pcDNA3.1+AngⅡ520.17±55.8236.81±4.922 165.04±147.53 pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ410.25±41.87&20.58±3.20&1 856.22±114.10&

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

6 HSF1減少AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中CHOP和ATF6蛋白表達(dá)

AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中CHOP和ATF6蛋白水平增多；過表達(dá)HSF1后的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，細(xì)胞中CHOP和ATF6蛋白水平減少(P<0.05)，見圖3。HSF1具有抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。

Figure 3.The effects of HSF1 over-expression on the protein levels of CHOP and ATF6 in vascular endothelial cells after Ang II induction. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

圖3 過表達(dá)HSF1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后細(xì)胞中CHOP和ATF6蛋白水平的影響

討 論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是一種慢性的炎性、免疫性疾病，其與內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞損傷有關(guān)，AngⅡ是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的促進(jìn)因子，其可以造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)血管組織功能異常[5-6]。AngⅡ能夠增加血管內(nèi)皮的通透性，引起細(xì)胞因子和炎癥因子等的表達(dá)，滅活NO，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生[7]。ET-1和NO是維持血管功能的細(xì)胞因子，內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，舒血管物質(zhì)NO分泌水平減少，而縮血管物質(zhì)ET-1分泌水平增加[8-10]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，AngⅡ處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中釋放的LDH水平升高，分泌的NO含量降低，ET-1分泌水平升高，說明AngⅡ能夠引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。

血管內(nèi)皮細(xì)胞過度凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要原因之一，AngⅡ作為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的誘導(dǎo)因子，其可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，致使血管組織完整性受到破壞[11]。Caspase是參與細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵蛋白家族之一，其可以被細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活，誘導(dǎo)caspase蛋白成員激活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，其位于caspase凋亡反應(yīng)的下游，caspase-3活化水平的高低是細(xì)胞凋亡水平的標(biāo)志[12-13]。CHOP和ATF6是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白，二者表達(dá)水平升高可以激活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)caspase凋亡反應(yīng)發(fā)生[14-15]。HSF1的抗細(xì)胞凋亡作用目前在腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中已經(jīng)被證實(shí)[16-18]。本研究顯示，高表達(dá)HSF1的血管內(nèi)皮細(xì)胞在AngⅡ處理后，細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞中活化的caspase-3蛋白水平降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP和ATF6表達(dá)水平也下降，說明HSF1能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

炎癥因子是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的促進(jìn)因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等都可以分泌炎癥因子，動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，過量的炎癥因子可以損傷周圍的正常組織和細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡發(fā)生[19-20]。TNF-α、IL-6和IL-1β等細(xì)胞因子具有促進(jìn)炎癥的作用，其在動(dòng)脈粥樣硬化組織中表達(dá)上調(diào)，AngⅡ能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎癥因子[21]。研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)[22]。HSF1是一種重要的炎癥調(diào)控因子，在巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抑制作用[20-23]。本研究顯示，高表達(dá)HSF1的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β減少，HSF1具有抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子分泌的作用。

總之，HSF1在AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，高表達(dá)HSF1能夠減少AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌，作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。HSF1在動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮抑制作用，對(duì)于其具體的作用機(jī)制尚不清楚，在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)進(jìn)行深入探討。