CASC2/miR-18a/BTG3信號(hào)抑制非小細(xì)胞肺癌遷移和侵襲*

陳興峰， 王應(yīng)瓊， 陳亞紅， 王茂澤， 陳 山， 許鐵峰， 石慧芳△

(1海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 海南 ?？?570311； 2海南醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所附屬醫(yī)院腫瘤外科， 海南 海口 570102)

肺癌是世界范圍內(nèi)危害最為嚴(yán)重的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。據(jù)2013年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在我國(guó)約73.28萬(wàn)人被確診為肺癌，該病死亡的人數(shù)多達(dá)58.07萬(wàn)人，其中男性的發(fā)病率約為女性的1.5倍[2]。肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)2種不同的亞型，其中NSCLC占所有肺癌病例的80～85%[3]。NSCLC在發(fā)病早期多不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，被許多患者及家屬忽視從而延誤病情，約65%的病人在確診時(shí)已發(fā)展為晚期肺癌或癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[4]。目前，手術(shù)和化療是治療NSCLC常用的方法，隨著臨床治療技術(shù)的不斷改善，患者的總生存時(shí)間在一定程度上也有所提高，但預(yù)后效果仍不十分理想，患者5年的生存率低于16%[5-6]。因此，研究NSCLC的發(fā)生機(jī)制并提出一種潛在的生物學(xué)靶點(diǎn)將為NSCLC的早期診斷和臨床治療提供新思路。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類超過(guò)200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的不具有蛋白編碼能力的RNA。在早期，lncRNA常被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”，隨著研究的深入，lncRNA在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄和翻譯、蛋白修飾中的功能被廣泛證實(shí)。CASC2(cancer susceptibility 2)是位于染色體10q26上的一種lncRNA，最早于2004年在子宮內(nèi)膜癌中被鑒定[7]，可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和遷移等過(guò)程[8]。CASC2是一種重要的腫瘤抑制因子，在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)CASC2的異常低表達(dá)，如膠質(zhì)瘤[9]、胃癌[10]、結(jié)腸直腸癌[11]等，但CASC2在NSCLC發(fā)生展中的作用機(jī)制還有待深入研究。本研究探討CASC2過(guò)表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，并分析CASC2、微小RNA-18a (micro-RNA-18a,miR-18a)和BTG3(B-cell translocation gene 3)三者的靶向關(guān)系及相互調(diào)控作用。通過(guò)分析CASC2在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)、功能和調(diào)控機(jī)制，揭示NSCLC的發(fā)生機(jī)制，為該病的臨床診斷提供可靠的生物學(xué)靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

人胚胎腎細(xì)胞系293T、人支氣管上皮細(xì)胞系16-HBE及人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 293T、16-HBE、A549和H1299細(xì)胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清(Gibco)和1%青鏈霉素(Invitrogen)的RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)中，并置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)85%以上時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入0.25%的胰蛋白酶(Sigma)消化后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)基，再加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 CASC2重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-CASC2)、CASC2干擾質(zhì)粒(si-CASC2)、miR-18a 模擬物(miR-18a)及陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-18a抑制劑(anti-miR-18a)及陰性對(duì)照(anti-miR-NC)均購(gòu)自GenePharma。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)后，利用Lipofectmine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)將上述質(zhì)?；蚬押塑账徂D(zhuǎn)染到細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，檢測(cè)各指標(biāo)的變化。

2.3RT-qPCR檢測(cè)RNA表達(dá) 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，NanoDrop 2000測(cè)RNA濃度，分別利用Reverse Transcription System Kit(TaKaRa)和miRNA First-Stand cDNA Synthesis Kit(GeneCopoeia)對(duì)lncRNA和miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；使用2×SYBR Green Master Mix(Invitrogen)在螢光定量PCR儀上測(cè)定各lncRNA和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，分別以GAPDH和U6作為內(nèi)參照。CASC2的上游引物序列為5′-GCACATTGG ACGGTGTTTCC-3′，下游引物序列為5′-CCCAGTCCTTCACAGGTCAC-3′；BTG3的上游引物序列為5′-GCAGTTGAGAGGTTTGCTGA-3′，下游引物序列為5′-TAACTTTCCTGGAGATCTCATT-3′；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。miR-18a及內(nèi)參照U6的引物由Applied Biosystems合成。

2.4Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力 侵襲實(shí)驗(yàn)開始前，需要在小室內(nèi)膜鋪上EMC膠以模仿細(xì)胞外基質(zhì)，而遷移實(shí)驗(yàn)不要加入EMC膠。將質(zhì)?；蚬押塑账徂D(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，48 h后用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌后加入不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L。向Transwell上室內(nèi)加入100 μL的細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入500 μL含10%血清的完全培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出，用甲醇固定10 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，選取10個(gè)視野并計(jì)算每個(gè)視野中的平均細(xì)胞數(shù)。

2.5雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用特異性引物擴(kuò)增CASC2和BTG3 3′-UTR片段中含miR-18a結(jié)合位點(diǎn)的序列，之后克隆到psiCHECKTM-2報(bào)告質(zhì)粒中分別構(gòu)建CASC2-WT和BTG3-WT報(bào)告質(zhì)粒。使用點(diǎn)突變?cè)噭┖?TaKaRa)對(duì)CASC2-WT和BTG3-WT報(bào)告質(zhì)粒上的miR-18a結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建CASC2-MUT和BTG3-MUT報(bào)告載體。將CASC2和BTG3野生型或突變型報(bào)告質(zhì)粒與miR-18a或miR-NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，48 h后利用雙螢光素酶報(bào)告分析試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的螢光素酶活性。

2.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清，BCA法測(cè)蛋白含量。取相同含量的蛋白加入上樣緩沖液煮沸5 min，之后進(jìn)行10% SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，37 ℃、 5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入抗BTG3抗體孵育2 h，再加入相應(yīng) II 抗孵育1.5 h，最后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯色，β-actin作為內(nèi)參照，蛋白相對(duì)表達(dá)量采用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CASC2在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)和功能分析

采用RT-qPCR檢測(cè)NSCLC細(xì)胞中CASC2的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常支氣管上皮16-HBE細(xì)胞相比，NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299中的CASC2表達(dá)水平均顯著降低，其中，A549細(xì)胞中CASC2的表達(dá)水平最低(P<0.05)，見圖1A，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇A549細(xì)胞為研究對(duì)象。為進(jìn)一步研究CASC2對(duì)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，我們?cè)贏549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC2，并采用RT-qPCR檢測(cè)CASC2表達(dá)，結(jié)果顯示，與pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組相比，pcDNA-CASC2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CASC2的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖1B，由此證實(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC2可成功構(gòu)建CASC2過(guò)表達(dá)模型。轉(zhuǎn)染48 h后采用Transwell小室法分析CASC2過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，與pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組相比，CASC2過(guò)表達(dá)后NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，見圖1C、D。上述結(jié)果表明，CASC2過(guò)表達(dá)可抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

Figure 1.The expression of CASC2 in NSCLC cells and its effects on the cell migration and invasion abilities. A: the expression of CASC2 in the NSCLC cell lines; B: the transfection efficiency of CASC2-overexpressing plasmid in A549 cells; C: the effect of CASC2 overexpression on A549 cell migration ability; D: the effect of CASC2 over-expression on A549 cell invasion ability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs16-HEB cells;#P<0.05vspcDNA3.1 group.

圖1 CASC2在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2 CASC2與miR-18a的靶向驗(yàn)證

本研究利用StarBase軟件預(yù)測(cè)與CASC2互補(bǔ)結(jié)合的miRNA，結(jié)果顯示，miR-18a序列中存在與CASC2互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸位點(diǎn)，見圖2A。之后采用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步探究CASC2與miR-18a的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-18a過(guò)表達(dá)顯著抑制了CASC2-WT的螢光素酶活性(P<0.05)，但對(duì)CASC2-MUT螢光素酶活性無(wú)影響(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，敲減miR-18a表達(dá)顯著促進(jìn)了CASC2-WT的螢光素酶活性，但對(duì)CASC2-MUT螢光素酶活性無(wú)影響,見圖2B、C。由此得知，CASC2能夠通過(guò)互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)與miR-18a發(fā)生相互作用。

Figure 2.The interaction between CASC2 and miR-18a. A: the predicted result of StarBase software; B: the effect of miR-18a over-expression on CASC2 luciferase activity in 293T cells; C: the effect ofmiR-18aknockdown on CASC2 luciferase activity in 293T cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vsanti-miR-NC group.

圖2 CASC2與miR-18a的靶向關(guān)系的驗(yàn)證

3 CASC2靶向miR-18a調(diào)控肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

在本研究中，我們首先采用RT-qPCR對(duì)miR-18a在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與16-HBE細(xì)胞相比，A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)水平均顯著升高，其中A549細(xì)胞中的miR-18a水平升高最顯著(P<0.05)，見圖3A。之后，采用RT-qPCR法測(cè)定CASC2對(duì)miR-18a表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，CASC2上調(diào)明顯抑制miR-18a表達(dá)(P<0.05)，與si-NC組相比，敲減CASC2表達(dá)明顯促進(jìn)miR-18a表達(dá)(P<0.05)，說(shuō)明CASC2能夠負(fù)調(diào)控miR-18a表達(dá)，見圖3B。為進(jìn)一步研究CASC2是否通過(guò)抑制miR-18a表達(dá)參與肺癌細(xì)胞功能的調(diào)控，我們分別在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CASC2或共表達(dá)CASC2和miR-18a，并采用Transwell小室法測(cè)定各組細(xì)胞的遷移和侵襲情況，結(jié)果顯示，CASC2過(guò)表達(dá)抑制了A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而外源回補(bǔ)miR-18a可逆轉(zhuǎn)CASC2對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用(P<0.05),見圖3C、D。由此可知，CASC2通過(guò)調(diào)控miR-18a表達(dá)抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

4 BTG3與miR-18a的靶向關(guān)系驗(yàn)證

本研究利用TargetScan軟件對(duì)miR-18a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，BTG3是miR-18a的一個(gè)潛在靶基因，見圖4A。之后采用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步探究miR-18a與BTG3的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-18a過(guò)表達(dá)顯著抑制了BTG3-WT的螢光素酶活性(P<0.05)，但對(duì)BTG3-MUT螢光素酶活性無(wú)影響；與anti-miR-NC組相比，miR-18a敲低顯著促進(jìn)了BTG3-WT的螢光素酶活性(P<0.05)，但對(duì)BTG3-MUT螢光素酶活性無(wú)影響，見圖4B、C。由此得知，miR-18a能夠與BTG3發(fā)生靶向結(jié)合。

Figure 3.The regulatory effects of CASC2 on miR-18a expression and functions. A: the expression of miR-18a in the NSCLC cell lines; B: the effect of CASC2 overexpression or knockdown on miR-18a expression in A549 cells; C: the effect of exogenous restoration of miR-18a on CASC2-inhibited A549 cell migration; D: the effect of exogenous restortaion of miR-18a on CASC2-inhibited A549 cell invasion. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs16-HEB cells;#P<0.05vspcDNA3.1 group;△P<0.05vssi-NC group;&P<0.05vspcDNA-CASC2+miR-NC group.

圖3 CASC2對(duì)miR-18a表達(dá)和功能上的調(diào)控

Figure 4.The interaction between miR-18a and BTG3. A: the predicted result of TargetScan software; B: the effect of miR-18a overexpression on BTG3 luciferase activity in 293T cells; C: the effect ofmiR-18aknockdown on BTG3 luciferase activity in 293T cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vsanti-miR-NC group.

圖4 miR-18a與BTG3的靶向關(guān)系驗(yàn)證

5 CASC2通過(guò)miR-18a調(diào)控BTG3的表達(dá)

采用Western blot法對(duì)BTG3在肺癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與16-HBE細(xì)胞相比，A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中BTG3的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見圖5A。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-18a上調(diào)可抑制BTG3-WT螢光素酶活性，而外源回補(bǔ)CASC2逆轉(zhuǎn)了miR-18a對(duì)BTG3-WT螢光素酶活性的抑制作用(P<0.05),見圖5B。Western blot分析結(jié)果顯示，CASC2上調(diào)促進(jìn)了BTG3蛋白表達(dá)，而外源回補(bǔ)miR-18a逆轉(zhuǎn)了CASC2對(duì)BTG3蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05),見圖5C；敲減CASC2表達(dá)抑制了BTG3蛋白表達(dá)，而外源性抑制miR-18a逆轉(zhuǎn)了敲減CASC2對(duì)BTG3蛋白表達(dá)的抑制作用(圖5D)。由此說(shuō)明，CASC2通過(guò)與BTG3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-18a調(diào)控BTG3蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響NSCLC進(jìn)程。

Figure 5. The interactions among CASC2, miR-18a and BTG3. A: the protein expression of BTG3 in the NSCLC cell lines; B: the effect of CASC2 restoration on miR-18a-inhibited BTG3-WT luciferase activity in 293T cells; C: the effect of miR-18a restoration on CASC2-induced BTG3 protein expression in A549 cells; D: the effect of miR-18a inhibitor (anti-miR-18a) on si-CASC2-repressed BTG3 protein expression in A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs16-HBE cells;#P<0.05vsBTG3-WT group;&P<0.05vsBTG3-WT+miR-18a+pcDNA 3.1 group;△P<0.05vspcDNA3.1 group;▲P<0.05vspcDNA-CASC2+miR-NC group;☆P<0.05vssi-NC group;★P<0.05vssi-CASC2+anti-miR-NC group.

圖5 CASC2、miR-18a和BTG3之間的相互調(diào)控分析

討 論

NSCLC是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，近年來(lái)，新型細(xì)胞毒藥物和靶向生物制劑的開發(fā)在一定程度上改善了NSCLC患者的生存質(zhì)量，但晚期肺癌患者的預(yù)后仍不理想，因此闡明NSCLC的形成和發(fā)展機(jī)制，以探索新的臨床治療靶向治療方法，提高患者的生存率仍是目前研究的重點(diǎn)。隨著人類基因組計(jì)劃的不斷開展，研究人員發(fā)現(xiàn)在人類基因組中絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雖然不具備編碼蛋白的能力，但仍可參與調(diào)控包括個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖等在內(nèi)的多種生命過(guò)程，lncRNA即為其中的一種非編碼RNA[12]。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA對(duì)包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病具有潛在的診斷和治療價(jià)值。例如，Zhang等[13]通過(guò)研究證實(shí)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織中上調(diào)的lncRNA MALAT1與患者的晚期臨床癥狀和不良預(yù)后密切相關(guān)；Zheng等[14]證實(shí)在結(jié)腸直腸癌患者組織中，lncRNA MALAT1表達(dá)水平顯著升高，升高的MALAT1可導(dǎo)致患者的不良預(yù)后和嚴(yán)重的臨床病理特征，且與癌細(xì)胞的噬神經(jīng)侵襲密切相關(guān)；lncRNA H19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯升高，且H19表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小、血管生成和不良預(yù)后等均密切相關(guān)[15]；lncRNA HMlincRNA717的水平與腫瘤組織學(xué)分級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者總生存期具有一定的相關(guān)性[16];外源敲減PVT1表達(dá)可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[17]。以上研究表明，有必要對(duì)NSCLC中的lncRNAs進(jìn)行篩選鑒定，以發(fā)現(xiàn)更多的與腫瘤相關(guān)的lncRNAs，為NSCLC的診斷和治療提供潛在的生物靶點(diǎn)。

CASC2是一種常見的抑癌因子，在多種腫瘤發(fā)生中的作用已被廣泛證實(shí)。本研究中，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CASC2在NSCLC細(xì)胞中出現(xiàn)異常的低表達(dá)，且深入的功能研究揭示，外源過(guò)表達(dá)CASC2可明顯降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。最新的研究表明，在NSCLC患者腫瘤組織中CASC2表達(dá)水平顯著下調(diào)，異常表達(dá)的CASC2與患者的不良預(yù)后及晚期病理分期密切相關(guān)，且外源過(guò)表達(dá)CASC2可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖活性[18]。該研究與我們的結(jié)果一致。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA主要發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的功能與mRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNAs，最終參與調(diào)控腫瘤的形成。NSCLC組織和細(xì)胞中上調(diào)的lncRNA NEAT1可通過(guò)抑制miR-181a-5p促進(jìn)下游靶基因HMGB1表達(dá)的升高，最終誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)[19]；SNHG1通過(guò)與SOX9競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-101-3p釋放更多的SOX9，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在NSCLC中發(fā)揮促腫瘤形成作用[20]；TP53TG1可通過(guò)調(diào)控miR-18a/PTEN通路增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞對(duì)順鉑藥物化療的敏感性[21]。為進(jìn)一步研究CASC2在調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制，我們利用生物信息學(xué)分析、雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和qRT-PCR證實(shí)CACS2可通過(guò)與miR-18a互補(bǔ)結(jié)合抑制miR-18a表達(dá)。miR-18a作為一種重要的腫瘤調(diào)控因子在NSCLC中發(fā)揮重要的促腫瘤形成作用[22]。功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，CACS2可通過(guò)下調(diào)miR-18a表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

BTG3基因定位于人染色體21q21.1上，其編碼的蛋白可調(diào)控多種細(xì)胞的周期進(jìn)程和分化，是一種抑制細(xì)胞增殖的蛋白，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌重要的作用，如卵巢癌[23]、食管癌[24]和肺癌[25]等。本研究中，我們通過(guò)TargetScan生物預(yù)測(cè)軟件初步證實(shí)BTG3是miR-18a的一個(gè)潛在靶基因，雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示miR-18a可抑制BTG3-WT螢光素酶活性，但外源回補(bǔ)CASC2可促進(jìn)BTG3-WT螢光素酶活性。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)CASC2促進(jìn)了BTG3蛋白表達(dá)，但外源回補(bǔ)miR-18a可抑制BTG3蛋白表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明，CASC2可通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-18a促進(jìn)BTG3表達(dá)。

綜上所述，在NSCLC中，lncRNA CASC2表達(dá)水平明顯降低；CASC2可通過(guò)與BTG3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-18a發(fā)揮對(duì)BTG3蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究首次證實(shí)CASC2/miR-18a/BTG3網(wǎng)絡(luò)在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用，提示CASC2可能作為臨床治療NSCLC的潛在生物靶點(diǎn)。