鯉春病毒血癥病毒截短糖蛋白的原核表達(dá)及抗體制備

林婧楠，趙景壯，徐黎明，劉 淼，任廣明，盧彤巖

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；3.上海海洋大學(xué)國家水生動(dòng)物病原庫，上海 201306)

鯉春病毒血癥(spring virernia of carp，SVC)是當(dāng)前國際動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)必報(bào)的重要疫病之一，也是2008年我國頒布的動(dòng)物疫病名錄中的一類動(dòng)物疫病[1]。該病常在春季爆發(fā)，能夠引起鯉科魚類大量死亡。該病最開始在中世紀(jì)歐洲大部分地區(qū)流行，我國首次報(bào)道是劉葒等[2]在2003年從無臨床癥狀的觀賞魚中分離出鯉春病毒血癥病毒(spring virernia of carp virus，SVCV)。目前該病已嚴(yán)重威脅我國淡水養(yǎng)殖以及觀賞魚的出口問題，因此建立良好的檢測(cè)方法尤為重要。

SVCV是一種高傳染性、高致病性的彈狀病毒[3]。從3′端到5′端編碼5種蛋白分別為核蛋白(Nuclear protein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(Matrixprotein，M)、糖蛋白(Glycoprotein，G)和RNA聚合酶(RNA polymerase，L)[4]。根據(jù)糖蛋白的核酸序列，可將SVCV分成Ia、Ib、Ic和Id 4個(gè)基因型[5]，而目前我國SVCV分離株的基因型均為Ia[6,7]。

G蛋白是位于病毒粒子上長釘狀的突起，因其含有抗原決定簇，在免疫應(yīng)答方面起到?jīng)Q定性的作用[8,9]。目前，國內(nèi)外大部分關(guān)于SVCV單克隆抗體和多克隆抗體的制備多基于G蛋白。本研究以SVCV黑龍江分離株shlj1為研究對(duì)象，通過對(duì)SVCV shlj1毒株G蛋白氨基酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)域及B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)，選取富含抗原表位的G蛋白基因片段進(jìn)行體外原核表達(dá)及純化，以制備抗血清，建立SVCV的免疫學(xué)檢測(cè)方法，為SVC疫病監(jiān)測(cè)提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

毒株：課題組在東北地區(qū)養(yǎng)殖鯉流行病調(diào)查中分離保存5株毒株(黑龍江?。篠VCV-shlj1、SVCV-shlj2、SVCV-shlj3，遼寧?。篠VCV-ln201801、SVCV-ln201802)，其中SVCV-shlj1病毒滴度為106.28TCID50/mL[10]；細(xì)胞株：黑頭呆魚上皮細(xì)胞(Epithelioma papulosum cyprini，EPC)由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所魚類病害防治教研室曾令兵教授惠贈(zèng)；載體：pET-32a表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性內(nèi)切酶、rTaq酶、Trizol、DL2000 DNA Marker、大腸桿菌(E.coli)DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T克隆載體、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver2.0試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，T4連接酶購自NEB公司，DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購自Abcam公司，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)購自Sigma Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的SVCV分離株shlj1的基因序列(NCBI登錄號(hào)：KX911973)，應(yīng)用TMHMM Server在線分析軟件及DNAStar 6.0(Protean)軟件對(duì)G全長蛋白的跨膜區(qū)域及抗原指數(shù)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，篩選出G截短蛋白的區(qū)域，在其上下游分別插入BamH I(GGATCC)或者SalI(GTCGAC)酶切位點(diǎn)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增SVCV G截短蛋白基因的引物，根據(jù)其結(jié)果，上游引物為5′ GGATCCTGGATCGATCATGAATTCAATGGGG 3′，下游引物為5′ GTCGACAGTATATTCTACCACATTTTCC 3′，引物由長春庫美生物公司合成。

1.2.2 目的片段的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用Trizol法提取SVCV shlj1毒株總RNA，以其為模板，利用TaKaRa公司的One Step RT-PCR Kit試劑盒擴(kuò)增目的基因。將獲取的目的基因膠回收，克隆至pMD18-T simple載體中，通過菌液PCR鑒定，鑒定為陽性的單菌落經(jīng)測(cè)序確認(rèn)無誤，提取質(zhì)粒命名為：pMD18-T-G。將pMD18-T-G質(zhì)粒和pET-32a載體分別利用BamH I、SalI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物膠回收后，利用T4連接酶，16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)中，涂于含有氨芐青霉素抗性的LB平板中培養(yǎng)，挑取單菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定。鑒定為陽性的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，最終鑒定正確的質(zhì)粒命名為：pET-32a-G。

1.2.3 G蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET-32a-G重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta表達(dá)菌株中。由于商業(yè)化的Rosetta表達(dá)菌株已經(jīng)含有一個(gè)增強(qiáng)外源蛋白表達(dá)的質(zhì)粒，因此本研究利用PCR方法對(duì)重組菌進(jìn)行鑒定。挑取陽性的重組菌，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600值為0.5左右，向其中添加終濃度為0.25 mmol/L的IPTG，分別在未誘導(dǎo)前，以及誘導(dǎo)后2-6 h，每隔1 h，取2 mL菌液，離心(1 min，10 000 r/min)。用PBS重懸菌體后超聲破碎，留取破碎后的全菌、菌液上清和菌液沉淀，并向其中加入蛋白上樣緩沖液后煮沸，利用12% SDS-PAGE電泳對(duì)重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.2.4 重組G蛋白的純化

收集誘導(dǎo)后(37 ℃，6 h)的陽性重組菌(500 mL)，采用蛋白變性復(fù)性的方法對(duì)超聲破碎的菌體進(jìn)行純化[11]，經(jīng)變性液(含有8 mol/L尿素)變性12 h及復(fù)性液(含有2 mol/L尿素)復(fù)性8 h處理后，將復(fù)性后的蛋白樣離心，上清放置透析袋中，置于PBS緩沖液中透析36 h，每12 h換液。利用超微量核酸蛋白測(cè)定儀(ScanDrop200，德國耶拿)測(cè)定純化后蛋白的濃度，并利用12% SDS-PAGE電泳對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行分析。將純化后蛋白用細(xì)菌過濾器過濾后，分裝在無菌的EP管中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.5 試驗(yàn)動(dòng)物的免疫及血清收集

將純化后的重組G蛋白作為免疫原，選取6-8周齡、體重在20 g左右的雌性Balb/c小鼠，采用背部皮下多點(diǎn)注射法進(jìn)行免疫。G蛋白的免疫劑量為1 mg/kg，首免采用等體積的G蛋白與完全弗氏佐劑乳化免疫小鼠，10 d、20 d后進(jìn)行第2、3次免疫，采用等體積的G蛋白與不完全弗氏佐劑乳化免疫小鼠。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，用PBS緩沖溶液代替純化后G蛋白與乳化劑乳化免疫。第三次免疫結(jié)束10 d后，眼球采血，將血液置于37 ℃靜置1 h左右，3 000 r/min離心10 min分離出清亮的血清，分裝于無菌的EP管中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.6 抗體效價(jià)的分析

采用ELISA對(duì)抗體的效價(jià)進(jìn)行分析，設(shè)置空白組(PBS稀釋液)、陰性對(duì)照組(未免疫的小鼠血清)和實(shí)驗(yàn)組(鼠1、鼠2)。以純化后的G蛋白作為酶標(biāo)試劑板的包被物(終濃度為0.025 mg/mL)，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；以制備的鼠抗血清為一抗，設(shè)置一定的稀釋倍數(shù)(1∶10 000、20 000、40 000、80 000、160 000)，37 ℃孵育1 h；以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗(1∶10 000，稀釋)，37 ℃孵育1 h；多次洗滌后，加入TMB顯色液，37 ℃避光孵育10 min；最后，加入50 μL終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀下檢測(cè)OD450nm。當(dāng)ΔA=(A檢測(cè)孔-A空白孔)/(A陰性孔-A空白孔)>2.1時(shí)，結(jié)果為陽性。出現(xiàn)陽性時(shí)最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價(jià)[12]。

1.2.7 間接免疫熒光抗體試驗(yàn)

在六孔板中制備EPC細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長至90%時(shí)，以MOI(multiplicity of infection)0.1接種實(shí)驗(yàn)室保存的五株SVCV分離株，黑龍江3株(shlj1、shlj2和shlj3)及遼寧2株(ln201801和ln201802)，同時(shí)設(shè)置不接種任何病毒的細(xì)胞為陰性對(duì)照組。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，吸出培養(yǎng)液，用PBS多次清洗板孔后加入4%的多聚甲醛固定30 min；PBS再次清洗后加入細(xì)胞通透液進(jìn)行室溫通透20 min；將本實(shí)驗(yàn)制備的鼠抗血清(1∶1 000)以及FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶500)，依次加入到六板孔中，在37 ℃下各孵育1 h，最終用PBS清洗3次后，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 G蛋白抗原指數(shù)預(yù)測(cè)

利用TMHMM Server在線分析軟件對(duì)SVCV G蛋白的跨膜區(qū)域分析，結(jié)果顯示該蛋白存在一個(gè)跨膜區(qū)域，位于468～487 aa(圖1A)。同時(shí)利用DNAStar 6.0(Protean)軟件對(duì)SVCV G蛋白抗原指數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1B所示。SVCV G全長蛋白平均抗原指數(shù)為1.025，其中1-160 aa區(qū)域平均抗原指數(shù)為1.009，且含有一段低抗原性的信號(hào)肽；161-300 aa區(qū)域蛋白平均抗原指數(shù)為1.048；301-500aa區(qū)域蛋白平均抗原指數(shù)為1.035。因此，本研究選定抗原指數(shù)最高的非跨膜區(qū)域的氨基酸序列(161-300 aa，140 aa)作為原核表達(dá)的目標(biāo)蛋白序列。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及G蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

以SVCV shlj1病毒懸液提取的總RNA為模板，利用One Step RT-PCR Kit試劑盒擴(kuò)增目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示為單一特異性條帶，且與預(yù)期設(shè)計(jì)的大小相符(420 bp，圖2)。將G基因克隆至表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-G，并將其轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)中，經(jīng)菌液PCR鑒定，出現(xiàn)與目的條帶大小相吻合的單一特異性條帶(420 bp，圖3)。將菌液PCR鑒定為陽性的菌株，接種于LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，可以看到重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I或SalI單酶切后得到的單酶切產(chǎn)物與pET-32a-G質(zhì)粒大小相符(6 320 bp，圖4)；而經(jīng)BamH I和SalI雙酶切得到的雙酶切產(chǎn)物與目的片段大小相符(420 bp，圖4)。將該陽性重組質(zhì)粒pET-32a-G轉(zhuǎn)入Rosetta表達(dá)菌株，利用PCR方法再次進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示獲得的條帶大小與目的片段相符(420 bp，圖5)。

圖1 G蛋白的跨膜區(qū)及抗原指數(shù)預(yù)測(cè)Fig.1 The transmembrane domain and antigenic determinants analysis of SVCV G proteinA：跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)；B：抗原指數(shù)分析

圖2 G基因PCR擴(kuò)增的凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel analysis of G gene PCR productM.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-2.G基因片段PCR產(chǎn)物

圖3 pET-32a-G重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.3 PCR identification of pET-32a-G recombinant plasmidM.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.PCR陰性對(duì)照；2-6.PCR陽性鑒定產(chǎn)物

圖4 pET-32a-G重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.4 Dual-digestion of pET-32a-G recombinant plasmidM1.DL15000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-32a-G質(zhì)粒；2.BamH I單酶切；3.Sal I單酶切；4.BamH I和Sal I雙酶切；M2.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

圖5 含pET-32a-G質(zhì)粒的Rosetta表達(dá)菌PCR鑒定Fig.5 PCR identification of the Rosetta carrying pET-32a-GM.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照；2-7.陽性鑒定產(chǎn)物

2.3 重組G蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將未誘導(dǎo)的重組菌和誘導(dǎo)后重組菌的全菌、上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示沉淀中有明顯的蛋白條帶且大小與預(yù)期相符(35 kDa)，而上清中未見目的條帶(圖6)。該結(jié)果說明重組G蛋白主要存在于沉淀中，以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)；將陽性重組菌在37 ℃條件下誘導(dǎo)0～6 h，收集菌體沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示隨著誘導(dǎo)時(shí)間的不斷增加，目的蛋白含量不斷增加，且誘導(dǎo)6 h時(shí)的蛋白表達(dá)量相對(duì)最高(圖7)。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中均選擇6 h做為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

2.4 重組G蛋白的純化

將重組G蛋白大量表達(dá)(37 ℃，6 h)，收集菌體超聲破碎，離心后用復(fù)性液對(duì)菌體進(jìn)行多次清洗，向菌體中加入變性液，經(jīng)變性過夜、復(fù)性8 h以及PBS緩沖液透析24 h后，對(duì)樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，純化后的G蛋白為單一條帶，與目的條帶大小相符，約為35 kDa(圖8)。

圖6 G蛋白可溶性分析Fig.6 Soluble analysis of G proteinM.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2.誘導(dǎo)后的菌體總蛋白；3.誘導(dǎo)后的菌體上清蛋白；4.誘導(dǎo)后的菌體沉淀蛋白

圖7 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)G蛋白表達(dá)的影響Fig.7 G protein expression induced for different timesM.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2-6.誘導(dǎo)2～6 h的菌體蛋白

圖8 純化后的G蛋白Fig.8 Purified G proteinM.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后的G蛋白

2.5 鼠抗血清效價(jià)的分析

對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行3次免疫注射后，眼球取血，分離血清。以純化后的重組G蛋白(終濃度為0.025 mg/mL)作為抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)孔，以不同稀釋度的鼠抗血清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗(1∶10 000)，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示鼠抗血清稀釋倍數(shù)為(10 000、20 000、40 000、80 000)時(shí)，滿足ΔA>2.1，均呈陽性，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。稀釋倍數(shù)為160 000時(shí)，ΔA<2.1，呈陰性(圖9)。因此，本研究所制備的鼠抗SVCV G蛋白血清效價(jià)為1∶80 000。

圖9 抗SVCV G蛋白血清效價(jià)的ELISA分析Fig.9 ELISA analysis of mouse anti-SVCV G sera

2.6 IFAT的建立及應(yīng)用

將5株SVCV分離株(黑龍江3株：shlj1、shlj2、shlj3和遼寧2株：ln201801、ln201802)接種于EPC細(xì)胞爬片，待細(xì)胞病變后，收獲病變的細(xì)胞進(jìn)行固定和透化處理。然后分別加入制備的鼠抗血清為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光抗體試驗(yàn)，設(shè)置不接種任何病毒的細(xì)胞為陰性對(duì)照組。結(jié)果顯示，制備的鼠抗SVCV G截短蛋白血清均能與這5株SVCV分離株反應(yīng)，產(chǎn)生特異性綠色熒光，而陰性對(duì)照組未見特異性熒光(圖10)。

3 討論

SVC是OIE必報(bào)的重要疫病，也是我國水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃的主要疫病之一。該病一旦爆發(fā)將會(huì)嚴(yán)重影響到我國鯉科魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，建立精準(zhǔn)、快速的SVCV免疫學(xué)檢測(cè)方法尤為重要[12]。當(dāng)前用于檢測(cè)的免疫血清通常是將滅活病毒免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來獲得，該方法需要增殖大量病毒，操作復(fù)雜，成本高[13]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，重組表達(dá)外源病毒蛋白已成為制備出高效的免疫血清的主要手段。SVCV G蛋白做為病毒入侵細(xì)胞的介體，直接參與病毒感染的過程，同時(shí)作為最主要的保護(hù)性抗原，有較強(qiáng)的免疫原性，能夠決定血清型，是最常被用來制備免疫血清的蛋白[14]。

目前，SVCV G蛋白已在大腸桿菌、畢赤酵母和昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)[15-17]。但無論是利用畢赤酵母還是桿狀病毒表達(dá)SVCV G蛋白，均存在著表達(dá)量較低的缺點(diǎn)[18]。雖然原核表達(dá)系統(tǒng)無法對(duì)外源蛋白進(jìn)行糖基化、磷酸化等翻譯后的加工修飾，但其表達(dá)產(chǎn)物仍然具有較高的免疫原性，已被廣泛應(yīng)用于抗體的制備。如已利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗原制備了IHNV及IPNV的抗體[11,19]，并且這些抗體已經(jīng)成功應(yīng)用到病毒的血清學(xué)檢測(cè)。因此，考慮到原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單，成本低以及表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn)，本研究選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)SVCV G蛋白。蘭文升等[13]將SVCV-741毒株G蛋白全長基因直接克隆至表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)SVCV G蛋白存在于上清，純化后的蛋白濃度為1.7 mg/mL。而徐進(jìn)等[20]采用截短表達(dá)方式去掉SVCV-HN毒株G蛋白兩端的疏水區(qū)，結(jié)果證明截短表達(dá)的G蛋白濃度較高(4 mg/mL)。因此，本研究利用DNAStar 6.0(Protean)軟件對(duì)SVCV G蛋白抗原指數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，僅保留抗原指數(shù)最高的非跨膜區(qū)域(161～300 aa)進(jìn)行截短表達(dá)。結(jié)果顯示，本研究截短表達(dá)的SVCV G蛋白存在于沉淀當(dāng)中，純化后的蛋白濃度可高達(dá)4.2 mg/mL，且純化的G蛋白條帶單一，足夠用于鼠抗血清的制備。經(jīng)ELISA檢測(cè)證明利用該截短G蛋白制備的鼠抗血清效價(jià)可高達(dá)1∶80 000。將該鼠抗血清應(yīng)用于北方地區(qū)分離出的5株SVCV毒株的IFAT檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果顯示本研究所制備的鼠抗血清能夠識(shí)別SVCV表面天然結(jié)構(gòu)G蛋白，均能與這5株SVCV分離株發(fā)生特異性反應(yīng)，產(chǎn)生特異性熒光。上述結(jié)果表明，純化的重組G蛋白具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。紀(jì)鋒等[21]曾對(duì)SVCV-shlj1毒株G蛋白的抗原指數(shù)、親水性指數(shù)以及柔性區(qū)域進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SVCV-shlj1毒株G蛋白可能存在5個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域，分別為4～26 aa、145～157 aa、293～302 aa、315～327 aa、407～491 aa。本研究所選區(qū)域含有其中1個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域(293～302 aa)。該優(yōu)勢(shì)抗原表位可能是本研究SVCV截短G蛋白具有良好免疫原性的主要原因。

圖10 鼠抗SVCV G蛋白血清間接免疫熒光檢測(cè)Fig.10 IFA result of the mouse antisera against SVCV G proteinA.陰性對(duì)照組(正常EPC細(xì)胞)；B.SVCV-shlj1；C.SVCV-shlj2；D.SVCV-shlj3；E.SVCV-ln201801；F.SVCV-ln201802

目前我國SVCV現(xiàn)行基因型為Ia基因型。因此本研究選取Ia基因型的SVCV-shlj1毒株進(jìn)行抗原制備。利用該抗原制備的鼠抗血清能夠識(shí)別不同區(qū)域的5株SVCV分離株，該結(jié)果表明，本研究制備的鼠抗SVCV G蛋白血清可應(yīng)用于全國范圍的SVCV血清學(xué)檢測(cè)。