新疆巴州幼年與成年牦牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系多樣性分析

聶召龍 劉書杰 崔占鴻 潘 浩 柴沙駝 孫 璐 張曉衛(wèi) 馮宇哲

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院/青海省牦牛工程技術(shù)研究中心/青海省高原放牧家畜動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

牦牛作為青藏高原及其鄰近地區(qū)的優(yōu)勢品種，主要分布于海拔3 000米以上的地區(qū)。目前，中國約有1 600萬頭牦牛，主要分布在青海、西藏、四川、甘肅及新疆等地區(qū)[1-2]。新疆巴州牦牛是由上世紀(jì)20年代初，從西藏引入的牦牛，經(jīng)過近一個(gè)世紀(jì)，由蒙古族游牧民在特定環(huán)境下繁育形成的具有共同來源、體形外貌較一致、產(chǎn)肉性能良好、適應(yīng)性強(qiáng)的牦牛類群。研究表明，地理位置、家畜年齡、季節(jié)條件等在一定程度上能夠影響反芻動(dòng)物的生長狀況[3-4]。牦牛作為反芻家畜，瘤胃是其主要的消化場所，與其生產(chǎn)性能密切相關(guān)。而反芻動(dòng)物的瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)因年齡的增長而變化，所以探究不同年齡牦牛瘤胃微生物的變化規(guī)律，對于研究其瘤胃發(fā)育與代謝、營養(yǎng)調(diào)控關(guān)系具有重要意義[5-6]。

對于牦牛而言，幼年期是從斷奶到性成熟這段時(shí)間，約0.5～2歲之間。牦犢牛從母乳喂養(yǎng)過渡到采食飼料，隨著飼料攝入量的增加，其消化能力增強(qiáng)。牦牛在2～4歲之間時(shí)，其生長發(fā)育接近成熟，體形基本固定，絕對增重達(dá)到峰值。動(dòng)物成年期是指從生理成熟到開始衰老這段時(shí)間，牦牛約為4～8歲，成年牦牛組織器官發(fā)達(dá)，生理功能成熟，代謝水平穩(wěn)定，生產(chǎn)性能最高，是利用牦牛的最佳時(shí)機(jī)。本研究通過對比較分析疆巴州1歲幼年與4歲成年牦牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系的多樣性，探究在采食粗飼料條件下不同年齡牦牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系組成的差異性，以期為不同年齡牦牛飼養(yǎng)的瘤胃營養(yǎng)調(diào)控與科學(xué)補(bǔ)飼提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在新疆維吾爾自治區(qū)(以下簡稱“新疆”)巴州和靜縣新疆牦牛種牛場選取放牧飼養(yǎng)的同一牛群的1歲幼年巴州牦牛和4歲成年巴州牦牛各3頭，其中巴州牦牛是牦牛的一個(gè)地方品種名，在新疆巴州和靜縣均有分布。幼年組3頭公牦牛，體重123～127 kg；成年組3頭公牦牛，體重355～363 kg。在2018年10月中旬，將6頭牦牛于同一天屠宰，屠宰后采集其瘤胃內(nèi)容物并快速放入液氮中凍存，備用。

1.2 新疆巴州牦牛瘤胃微生物總DNA的提取

將37份幼年牦牛瘤胃內(nèi)容物等量混合，攪拌均勻后稱取0.15 g瘤胃內(nèi)容物倒入研缽中，37份成年牦牛瘤胃內(nèi)容物作相同處理。加入1.5 mL 1% CTAB抽提液，經(jīng)液氮研磨法處理后，倒入2 mL離心管中混勻，然后加入20 μL 10 mg·mL-1蛋白酶K和250 μL 10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)，65℃恒溫水浴2 h(注意每隔20 min顛倒混勻幾次)，最后 7 000×g 離心10 min，保留上清液。避開上層的漂浮物，取中層溶液，加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，然后于4℃條件下12 000×g離心5 min，取上層溶液，重復(fù)上述操作1次，至上清液無渾濁。將上述上清液混合，采用氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)萃取，然后于4℃條件下12 000×g離心5 min，保留上清液。于上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀2 h，于4℃條件下12 000×g離心15 min，棄上清液，然后用75%乙醇洗滌沉淀，晾干后用50 μL TE(pH值8.0，含10 mg·μL-1RNase)進(jìn)行溶解，在37℃恒溫水中浸泡30 min，得到總DNA溶解液，于-20℃保存。

1.3 新疆巴州牦牛瘤胃微生物總DNA濃度的測定

采用TU-1810APC紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)分別于260、280 nm波長處測定瘤胃微生物粗提DNA的吸光度值和濃度，計(jì)算OD260/OD280值。

DNA濃度(μg·mL-1)=A260×50 μg·mL-1×稀釋倍數(shù)。

1.4 凝膠電泳檢測

使用DYCZ-23A型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)對瘤胃微生物粗提DNA進(jìn)行凝膠電泳檢測(1%瓊脂糖)。電泳條件：調(diào)節(jié)電壓100 V，電泳30 min，當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1～2 cm處，停止電泳。使用WD-9413B凝膠成像分析儀(北京六一生物科技有限公司)觀察電泳條帶；凝膠成像分析系統(tǒng)處理瘤胃微生物DNA電泳結(jié)果。

1.5 16S rRNA基因擴(kuò)增瘤胃微生物DNA電泳結(jié)果

以5、10、25、50倍的瘤胃微生物總DNA稀釋液為模板，采用預(yù)混Taq法擴(kuò)增瘤胃微生物總DNA。反應(yīng)體系總體積為50 μL，其中模板為0.5 μL，引物(100 μmol·L-1)0.1 μL，premixed Taq 25 μL，ddH2O 24.3 μL。引物為27 F 5′-AGGATTATCM TGGCTCAG-3′和1492 R 5′-GGTTACTTGTTACGACT-3′。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后采用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測。

1.6 目的基因克隆及測序

采用PMD18-T Vector進(jìn)行目的DNA片段連接與純化回收。目的DNA片段的連接：4 μL DNA樣品、1 μL載體和15 μL DNA連接酶溶液，于16℃條件下反應(yīng)30 min。目的DNA片段的轉(zhuǎn)化：取感受態(tài)細(xì)胞，在冰上將感受態(tài)細(xì)胞融化(2 min)，然后加入10 μL上述連接體系，于冰上放置30 min，42℃熱激90 s，再于冰上放置3～5 min，加入500～700 μL液體LB培養(yǎng)基，最后于37℃搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞過夜培養(yǎng)后會(huì)在平板上形成很明顯的藍(lán)白色菌落，其中白色菌落代表陽性克隆。在無菌操作臺(tái)中，于氨芐青霉素(Ampicilin, AMP)抗性LB平板上提前涂布4 μL 1mol·L-1IPTG和40 μL 20 mg·μL-1X-gal，晾干。取已經(jīng)轉(zhuǎn)化完成的感受態(tài)細(xì)胞，4 000×g離心3 min，保留200 μL上清液。用移液槍將上清液中的感受態(tài)細(xì)胞吹打混勻，取100 μL進(jìn)行涂布平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行過夜培養(yǎng)。對陽性克隆進(jìn)行氨芐西林抗性和藍(lán)白斑篩選。隨機(jī)選擇300株單白細(xì)菌，在高頻振蕩培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)6～8 h。以M13F(-47)5′-C G C C G T T C C C A G T C A C G AC-3′和M13R(-48)5′-A G G A T A A C A A C A C G GA-3′作為引物進(jìn)行假陽性克隆檢驗(yàn)。送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)后確定為陽性克隆菌液。M13F(-47)5′-C G C C A G T T C C C A T C A C A C GA-3′和M13R(-48)5′-A GCGGA TaCaaT A T C A C A C A C GA-3′作為測序引物。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用 FLASH(V1.2.7)軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和質(zhì)控，得到有效數(shù)據(jù)，然后用 Qiime(V1.7.0)軟件過濾嵌合體，最后得到有效片段，用作后續(xù)分析。

利用 Uparse v7.0 軟件對全部有效片段進(jìn)行 OTUs 聚類，采用 Mothur 方法和 SILVA[7]的SSU rRNA 數(shù)據(jù)庫[8]對16S rRNA基因序列樣品進(jìn)行物種注釋，獲得樣品在門和屬水平上的分類信息，然后分別在門和屬水平上分析并統(tǒng)計(jì)2種16S rRNA基因序列樣本的群落組成，并用Alpha分析4個(gè)樣本菌群豐度及相對豐度。使用R語言計(jì)算Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，并繪制稀釋圖案，比較分析群的豐度和多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆巴州牦牛瘤胃微生物總DNA的提取結(jié)果

由圖3可知，成年巴州牦牛和幼年巴州牦牛的瘤胃微生物粗提DNA凝膠電泳獲得的條帶位置都遠(yuǎn)大于10 kb，說明從牦牛瘤胃微生物中均提取到了較為完整的大片段DNA片段。凝膠孔和條帶都比較明亮，說明粗提DNA中含有某些多糖、RNA片段和一些大分子物質(zhì)，也可能是部分DNA片段被降解所導(dǎo)致的。

表1 新疆巴州牦牛瘤胃微生物的粗提DNA OD260/OD280值及濃度Table 1 Crude extract DNA OD260/OD280 ratio and concentration of Bazhou yak in Xinjiang

Note: M: Marker.圖1 新疆巴州牦牛的瘤胃微生物粗提總DNA電泳圖Fig.1 Total DNA electrophoresis map of rumen microorganisms of Bazhou yak in Xinjiang

純DNA的OD260/OD280值范圍在1.7～2.0之間，當(dāng)OD260/OD280值大于2.0時(shí)，說明DNA樣品中含有較多的RNA雜質(zhì)；當(dāng)OD260/OD280值小于1.6時(shí)，說明DNA樣品中混有蛋白質(zhì)[9]。由表1可知，幼年巴州牦牛和成年巴州牦牛瘤胃微生物的DNA的OD260/OD280值分別為1.72、2.12，說明提取的成年牦牛瘤胃微生物DNA中含有部分RNA。OD260為1時(shí)相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50 μg·mL-1，OD260值越高，DNA濃度越大[9]。因此，本試驗(yàn)所提取的幼年巴州牦牛和成年巴州牦牛瘤胃微生物的DNA濃度均大于100 μg·mL-1。

2.2 新疆巴州牦牛牛瘤胃微生物目的基因的PCR擴(kuò)增及純化回收

由圖2可知，粗提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得的DNA片段大小為1.5 kb，用不同稀釋倍數(shù)的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其條帶的明亮程度不同，在此選用模板稀釋倍數(shù)最小且條帶最明亮的PCR產(chǎn)物用于后續(xù)試驗(yàn)，即成年巴州牦牛和幼年巴州牦牛均選擇模板5倍稀釋后獲得的PCR產(chǎn)物。

將用于后續(xù)試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收，回收的DNA為無色，且回收的樣品DNA OD260/OD280值在1.7～2.0之間，滿足較純DNA的要求，其回收率為50%～65%。純化回收后的DNA樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

注：從左到右每4個(gè)孔為一組，依次為該樣品DNA 5倍、10倍、25倍、50倍稀釋后的PCR結(jié)果。Note: From left to right, each of the four wells was a group, and the PCR results were 5 times, 10 times, 25 times and 50 times diulted DNA of the sample.圖2 新疆巴州牦牛瘤胃微生物的粗提DNA的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of crude DNA from rumen microorganisms of Bazhou yak in Xinjiang

2.3 新疆巴州牦牛瘤胃微生物目的基因的克隆及測序結(jié)果

轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞過夜培養(yǎng)后會(huì)在平板上形成很明顯的藍(lán)白色菌落，白色菌落代表陽性克隆。挑取300個(gè)陽性克隆單菌落高頻搖床培養(yǎng)6～8 h后，培養(yǎng)基由透明變渾濁，然后對這300個(gè)陽性克隆進(jìn)行假陽性克隆檢驗(yàn)。由圖3可知，陽性克隆在凝膠電泳圖中都具有條帶，且條帶大都出現(xiàn)在1.5 kb處；部分陽性克隆的條帶位置出現(xiàn)在小于1.5 kb處，說明此克隆在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)時(shí)與載體連接的DNA片段長度小于1.5 kb，這部分陽性克隆需要剔除。選擇在1.5 kb處有明亮條帶的陽性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果采用16S rRNA基因序列分析技術(shù)進(jìn)行分析。每個(gè)樣品符合這些條件的陽性克隆約有135個(gè)。

圖3 新疆巴州牦牛瘤胃微生物目的基因的假陽性克隆檢驗(yàn)?zāi)z電泳圖(部分)Fig.3 Gel electrophoresis of false positive clones of rumen microbial target genes of Bazhou yak in Xinjiang

2.4 新疆巴州牦牛瘤胃微生物目的基因的測序結(jié)果及嵌合體檢測

由表2可知，幼年巴州牦牛和成年巴州牦牛瘤胃微生物目的基因的陽性克隆送檢個(gè)數(shù)分別為145和138個(gè)。測序過程中會(huì)出現(xiàn)一部分序列測序失敗或送交的菌液是非單克隆而導(dǎo)致測序失敗的情況，因此幼年巴州牦牛和成年巴州牦牛胃微生物目的基因的陽性克隆中測序成功序列的個(gè)數(shù)分別為142和133個(gè)。使用Bellerophon軟件檢測可能的嵌合體序列，去除這些可能的嵌合體序列，最終幼年巴州牦牛和成年巴州牦牛胃微生物目的基因的陽性克隆中可用的基因序列個(gè)數(shù)分別為137和121個(gè)。

表2 新疆巴州牦牛瘤胃微生物目的基因陽性克隆基因的測序結(jié)果Table 2 Sequencing results of positive clones of target genes in rumen microorganisms of Bazhou yak in Xinjiang

2.5 新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌Mothur分析結(jié)果

相似性大于97%的序列劃分為一個(gè)操作歸類單元(operational taxonomic units, OTU)。OTUs數(shù)目越大，代表瘤胃微生物越豐富。Mothur分析結(jié)果顯示，幼年巴州牦牛瘤胃細(xì)菌共統(tǒng)計(jì)128個(gè)OTUs序列，成年牦牛共統(tǒng)計(jì)112個(gè)OTUs序列，表明幼年巴州牦牛瘤胃細(xì)菌較成年巴州牦牛瘤胃豐富。

2.6 新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌的優(yōu)勢菌群在門水平上的分析

厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的細(xì)菌均已在陸生哺乳動(dòng)物和海洋哺乳動(dòng)物腸道中檢測到，且探究了這2種細(xì)菌的多樣性豐度[9-10]。由表3、圖4和圖5可知，幼年巴州牦牛和成年巴州牦牛的瘤胃菌群被顯著分為兩類，其中厚壁菌門均占據(jù)較大比例，且有著很高的表達(dá)量，幼年巴州牦牛瘤胃內(nèi)厚壁菌門所占比例(70.31%)高于成年巴州牦牛瘤胃(66.96%)；擬桿菌門是巴州牦牛瘤胃內(nèi)的第二大優(yōu)勢菌門，同樣有著較高的表達(dá)量，在2個(gè)年齡段的巴州牦牛瘤胃菌群中所占比例略有不同，幼年巴州牦牛瘤胃內(nèi)擬桿菌門所占比例(21.87%)低于成年巴州牦牛(24.11%)；巴州牦牛瘤胃內(nèi)其他菌門所占比例都很少且表達(dá)量較低，其中軟皮菌門(Tenericutes)在成年巴州牦牛瘤胃內(nèi)占3.57%，在幼年巴州牦牛瘤胃內(nèi)僅占0.78%；疣孢菌門(Verrucomicrobia)在成年巴州牦牛瘤胃內(nèi)占0.89%，在幼年巴州牦牛瘤胃內(nèi)所占比例為2.34%。此外，疣孢菌門、變形桿菌門(Proteobacteria)和藍(lán)藻門(Cyanobacteria)在幼年巴州牦牛瘤胃中的表達(dá)量高于成年巴州牦牛，而軟皮菌門、纖維桿菌門(Fibrobacteres)和黏膠球形菌門(Lentisphaerae)在成年巴州牦牛瘤胃中的表達(dá)量高于幼年巴州牦牛。

圖4 新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌在門水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of rumen bacteria at phylum level of Bazhou yak in Xinjiang

表3 新疆巴州牦牛瘤胃中細(xì)菌在門水平上的分布Table 3 Distribution of bacteria in rumen at phylum level of Bazhou yak in Xinjiang

圖5 新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌在門水平上的熱圖Fig.5 Heat map of rumen bacteria at phylum level of Bazhou yak in Xinjiang

2.7 新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌的優(yōu)勢菌群在屬水平上的分析

細(xì)菌屬水平上的豐度分析較門水平上的豐度分析更加困難。由表4、圖6和圖7可知，屬水平上的豐度分析中，巴州牦牛牛瘤胃細(xì)菌被分為 2 類，能夠明確分類的只有很少一部分，更多的還不能分出類別，且未能分出類別的菌屬表現(xiàn)出很高的表達(dá)量，其類別和功能有待進(jìn)一步深入研究。能夠明確類屬的普雷沃菌屬(Prevotella)在幼年巴州牦牛瘤胃內(nèi)所占比例(4.69%)高于在成年巴州牦牛(2.68%)；瘤胃球菌屬(Ruminococcus)在幼年巴州牦牛瘤胃內(nèi)所占比例(4.69%)高于成年巴州牦牛(1.79%)；琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)在幼年巴州牦牛瘤胃內(nèi)所占比例(2.34%)低于成年巴州牦牛(4.46%)；丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)在幼年巴州牦牛瘤胃內(nèi)所占比例(5.47%)與成年巴州牦牛(5.35%)相差不大。此外，幼年巴州牦牛和成年巴州牦牛瘤胃細(xì)菌中不能分出類別的菌屬所占比例分別為70.31%、75.89%。

圖6 新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌在屬水平上的相對豐度圖Fig.6 Relative abundance map of rumen bacteria at genus level of Bazhou yak in Xinjiang

圖7 新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌在屬水平上的熱圖Fig.7 Heat map of rumen bacteria at genus level of Bazhou yak in Xinjiang

2.8 新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌的Alpha多樣性分析

Chao 1指數(shù)能夠表征物種的豐度；Shannon指數(shù)反映群落均勻度和多樣性的變化[11-13]。為探究幼年與成年巴州牦牛瘤胃細(xì)菌菌群的豐度差異，對聚類結(jié)果進(jìn)行Chao 1、Shannon 指數(shù)分析。由圖8、9可知，幼年巴州牦牛和成年巴州牦牛瘤胃細(xì)菌的Chao 1指數(shù)分別是783.50和544.00，Shannon指數(shù)分別是4.68和4.52，說明幼年巴州牦牛瘤胃內(nèi)細(xì)菌的豐度和細(xì)菌群落多樣性均高于成年巴州牦牛。

3 討論

牦牛瘤胃微生物復(fù)雜而多變，瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)和種群數(shù)量會(huì)因年齡的改變而改變。本研究結(jié)果表明，新疆幼年巴州牦牛菌群豐度高于成年巴州牦牛瘤胃，瘤胃細(xì)菌多樣性也更豐富。此外，幼年巴州牦牛瘤胃細(xì)菌能分類到門的OTUs是9個(gè)，能分類到屬的是17個(gè)。吳婷婷[14]研究羔羊的胃腸道菌群，分類到的門和屬的OTUs都是10個(gè)；Nathani等[15]發(fā)現(xiàn)印度野牛瘤胃微生物中能分類到門的OTUs是6個(gè)，能分類到的屬是14個(gè)；周熊艷等[16]在云南大額牛瘤胃微生物的研究中發(fā)現(xiàn)能分類到門的OTUs是9個(gè)，能分類到屬的是3個(gè)，但其能分類到種水平上的是10個(gè)。綜上，與其他反芻家畜相比，巴州牦牛的瘤胃細(xì)菌多樣性更豐富，表明牦牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系維持穩(wěn)態(tài)的能力更強(qiáng)，是牦牛適應(yīng)高海拔氣候環(huán)境條件和耐粗飼的良好表現(xiàn)。

表4 新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌在屬水平上的分布Table 4 Distribution of rumen bacteria at genus level of Bazhou yak in Xinjiang

研究表明，牦牛在消化器官結(jié)構(gòu)、放牧行為、氮利用效率、甲烷排放、季節(jié)間能量分布等方面均優(yōu)于黃牛，且從牦牛全基因組測序中找到了適應(yīng)高寒營養(yǎng)脅迫的相關(guān)功能基因[17]。推斷，長期的極端環(huán)境與營養(yǎng)脅迫，使細(xì)菌在牦牛瘤胃中分別形成了特殊的分布模式，以幫助宿主提高能量利用效率和有效應(yīng)對營養(yǎng)匱乏的情況。Eckburg等[18]和Ley等[19]推測厚壁菌門和擬桿菌門是哺乳動(dòng)物腸道中最主要的兩大菌門。已有報(bào)道證實(shí)，厚壁菌門和擬桿菌門在人類和貓科動(dòng)物的胃腸道菌群中均占有較高的豐度[20-21]。關(guān)于牛的研究也發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門是水牛和荷斯坦牛瘤胃內(nèi)細(xì)菌的優(yōu)勢菌門[22-23]；厚壁菌門是瘤胃中占比最多的優(yōu)勢菌門[24-27]。曹連賓等[28]報(bào)道，牦牛在放牧和舍飼兩種狀態(tài)下，瘤胃細(xì)菌都是以厚壁菌門為最優(yōu)勢菌門，擬桿菌門次之。本研究中，厚壁菌門也是巴州牦牛瘤胃中的最優(yōu)勢菌門，兩個(gè)不同年齡階段(幼年和成年)巴州牦牛瘤胃細(xì)菌OTUs序列分屬于擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門和放線菌門等9個(gè)菌門，其中厚壁菌門所占比例為66.96%～70.31%，擬桿菌門所占比例為21.87%～24.11%。此外，與其他品種牛的研究結(jié)果[29-30]相比，在幼年巴州牦牛瘤胃中還發(fā)現(xiàn)了藍(lán)藻門(Cyanobacteria)細(xì)菌。研究表明，在胃腸道中的藍(lán)藻門細(xì)菌主要參與維生素B和維生素K的合成[31]，這種細(xì)菌在幼巴州牦牛瘤胃中占高比例可能有助于牦牛發(fā)展強(qiáng)壯的骨骼，有效釋放能量和保持基因穩(wěn)定性以應(yīng)對青藏高原放牧系統(tǒng)的惡劣條件，如8個(gè)月的寒冷季節(jié)壓力、強(qiáng)烈紫外線和缺氧等。但需要進(jìn)一步研究來證實(shí)這一假設(shè)，并通過測量胃腸道和血液中的維生素水平為該假設(shè)提供更直接的證據(jù)。崔占鴻等[32]推測，青海放牧牦牛瘤胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌屬的相似序列數(shù)量明顯多于白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌3種纖維降解菌，本研究結(jié)果與之相似，溶纖維丁酸弧菌屬在幼年巴州牦牛瘤胃內(nèi)所占比例(5.47%)和在成年巴州牦牛瘤胃內(nèi)所占比例(5.35%)高于其他纖維降解菌，進(jìn)一步證明溶纖維丁酸弧菌屬對瘤胃內(nèi)纖維降解以及瘤胃發(fā)酵有著至關(guān)重要的作用。

圖8 新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌的Chao 1指數(shù)分析圖Fig.8 Chao 1 index analysis of rumen bacteria of Bazhou yak in Xinjiang

圖9 新疆巴州牦牛牛瘤胃細(xì)菌的Shannon指數(shù)分析圖Fig.9 Shannon index analysis of rumen bacteria of Bazhou yak in Xinjiang

瘤胃微生物的數(shù)量和種類會(huì)因諸多因素的不同而有所差異，包括動(dòng)物種類、動(dòng)物年齡、健康狀況和飼料等，其中動(dòng)物年齡是影響瘤胃微生物多樣性的主要因素之一[33-35]。Chao 1指數(shù)分析得到細(xì)菌中幼年巴州牦牛瘤胃細(xì)菌物種豐富度高于成年巴州牦牛，這可能是由于幼年巴州牦牛剛斷奶不久，瘤胃消化吸收的功能正在轉(zhuǎn)化建立的過程中[36]，隨著日齡的增加，食物中微生物不斷進(jìn)入瘤胃，且此時(shí)瘤胃還未形成穩(wěn)定的菌群區(qū)系，因此早期進(jìn)入到瘤胃中的各種微生物都有可能被檢測到。但隨著年齡的增加，瘤胃功能不斷完善，微生物區(qū)系逐漸趨于穩(wěn)定平衡，一些菌群逐漸被優(yōu)勢菌群取代甚至消失[37-38]。本試驗(yàn)中Shannon指數(shù)分析顯示，幼年巴州牦牛瘤胃細(xì)菌物種多樣性高，這可能是由于在瘤胃發(fā)育的早期，其內(nèi)部尚未建立有效的競爭機(jī)制，此時(shí)進(jìn)入瘤胃的微生物都可存在于瘤胃中，而成年后，隨著競爭機(jī)制的完善，一些菌群逐漸適應(yīng)了這種競爭機(jī)制而變成了優(yōu)勢菌群，而另一些菌群豐度變得很低甚至消失，物種多樣性減少[39]。

目前，瘤胃微生物只能培養(yǎng)10%～20%，微生物的研究主要依賴于純菌株的分離和鑒定，80%～90%的瘤胃微生物不能被識(shí)別和利用。本試驗(yàn)對新疆巴州牦牛瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的比較研究也只到屬水平，故下一步將致力于牦牛瘤胃微生物的分離和培養(yǎng)，更深入地探究牦牛瘤胃微生物的功能和穩(wěn)態(tài)機(jī)制。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，新疆巴州牦牛瘤胃微細(xì)菌的數(shù)量和種類會(huì)因年齡階段的不同而有所差異，幼年和成年巴州牦牛瘤胃細(xì)菌都是以厚壁菌門和擬桿菌門為主，兩者的表達(dá)量也相對較高，其他菌類所占比例較少，且牦牛瘤胃纖維降解菌主要分布于厚壁菌門，同時(shí)纖維降解菌是放牧牦牛瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌群，這與牦牛的生存環(huán)境較惡劣，主要采食粗飼料，需要消化大量纖維有關(guān)。牦牛瘤胃細(xì)菌多樣性也會(huì)因?yàn)槟挲g的變化而受到影響，幼年巴州牦牛瘤胃消化吸收的功能正在轉(zhuǎn)化建立的過程中，所以Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)，以及細(xì)菌物種豐度和多樣性均高于成年巴州牦牛。本研究主要分析在采食粗飼料條件下巴州1歲幼年牦牛和4歲成年牦牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系組成的差異性，為不同年齡牦牛飼養(yǎng)的瘤胃營養(yǎng)調(diào)控與科學(xué)補(bǔ)飼提供了參考依據(jù)。