60Co-γ射線輻射對翠冠和玉露香梨枝條的生物損傷效應(yīng)

石新杰 吳 瀟 陳楊楊 曹 鵬 白 冰 李明智 殷 豪,* 張紹鈴

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095；2 南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司，江蘇 南京 210014)

梨為薔薇科(Rosaceae)梨亞科(Pomaceae)梨屬(PyrusL.)多年生木本果樹。我國不僅是梨的起源地，也是世界第一大產(chǎn)梨國，梨已成為我國第三大果樹樹種，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。目前我國梨新品種選育主要是通過雜交育成，但木本果樹雜交育種存在周期長、效率低等問題，而輻射誘變育種具有突變率高、突變譜寬、改良單一性狀效果顯著、性狀能夠快速穩(wěn)定、育種周期短等優(yōu)點(diǎn)，已成為創(chuàng)造果樹新種質(zhì)的有效途徑[2]。1927年，Muller[3]首次發(fā)現(xiàn)X射線可以誘導(dǎo)果蠅某些性狀發(fā)生突變。經(jīng)過多年的發(fā)展，目前主要的物理誘變包括X、γ、β射線，熱中子輻射、紫外線、激光、離子注入等[2]，其中60Co-γ作為一種有效的物理誘變劑，在果蔬和花卉品種的培育與改良中得到了大量應(yīng)用，包括柚子[4]、澳洲堅(jiān)果[5]、蘋果[6]、香蕉[7]、葡萄[8]、辣椒[9]、牡丹種子[10]、菊花[11]、小麥[12]、菠蘿[13]等，并獲得了一大批優(yōu)質(zhì)性狀突變體，且部分經(jīng)過誘變獲得的品種已經(jīng)在生產(chǎn)上得到了廣泛的應(yīng)用。

我國梨輻射誘變研究始于1980年，蔣洪業(yè)[14]通過輻射梨休眠枝得到抗寒輻向陽紅梨；李志英等[15]利用60Co-γ射線輻射朝鮮洋梨和蘋果梨枝條，并育成具有早果、豐產(chǎn)、抗寒、樹體矮化、抗腐爛病、果品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)的優(yōu)良品系(如朝輻1號、朝輻2號等)；孟玉平等[16]利用60Co-γ射線輻射普通巴梨自然雜交的種子，培育出豐產(chǎn)性和抗逆性優(yōu)良的新品種晉巴梨。此外，對于碭山酥梨[17]和庫爾勒香梨[18]的休眠枝輻射也進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著輻射劑量的增加，萌芽率、新梢生長量和嫁接成活率均降低。國外對梨輻射誘變也進(jìn)行了大量研究，如日本研究者通過60Co-γ射線分別輻射長二十世紀(jì)、二十世紀(jì)和新水梨獲得了抗黑斑病的新品種長二十世紀(jì)IRB-502-12T[2]、金二十世紀(jì)[19]和壽新水[20]。荷蘭和英國的果樹育種家通過輻射處理獲得了早熟、矮化突變系[21]。雖然當(dāng)前國內(nèi)外科研工作者在梨誘變育種取得一些成績，但仍存在鑒定方法不完善、突變方向和性質(zhì)難掌握等問題。

翠冠梨是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所以幸水×(杭青×新世紀(jì))雜交培育成的優(yōu)質(zhì)早熟豐產(chǎn)梨品種，其具有果個(gè)大、肉質(zhì)酥脆、石細(xì)胞少、汁多味甜、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為我國長江流域及其南方地區(qū)發(fā)展最為迅速的早熟梨品種之一[22]。玉露香梨是山西果樹研究所以庫爾勒香梨×雪花梨雜交培育成的優(yōu)質(zhì)、耐藏、中熟梨優(yōu)質(zhì)新品種，具有果個(gè)大、果心小、果肉細(xì)、風(fēng)味佳、成熟早、供應(yīng)期長等特點(diǎn)[23]。本試驗(yàn)利用60Co-γ射線對翠冠梨和玉露香梨的休眠枝條進(jìn)行輻射誘變處理，研究輻射對二者的生物損傷效應(yīng)，旨在通過輻射誘變改善翠冠梨表皮果銹和玉露香梨在南方區(qū)域種植僵芽、區(qū)域性強(qiáng)等缺點(diǎn)，以期為梨輻射誘變育種，創(chuàng)制優(yōu)異梨種質(zhì)資源提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)中心湖熟試驗(yàn)基地6年生翠冠和玉露香梨樹一年生枝條，于休眠期剪取，每個(gè)品種每個(gè)處理剪取30根枝條，每個(gè)枝條帶3～4個(gè)飽滿芽。枝條剪取后立即用報(bào)紙包裹嚴(yán)實(shí)，并用清水打濕，0℃保存?zhèn)溆谩?/p>

剪取的枝條在南京航空航天大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院進(jìn)行60Co-γ輻射處理，輻射劑量分別20、30、40、50 Gy，劑量率為1 Gy·min-1，輻射時(shí)間分別為20、30、40、50 min，以未經(jīng)輻射處理的枝條為對照(control，CK)。經(jīng)輻射處理的枝條于次日嫁接于江浦試驗(yàn)基地生長較好的7年生梨樹，嫁接后其他措施同常規(guī)管理，觀察其生長情況。

1.2 方法

1.2.1 生長指標(biāo)及葉綠素含量測定 于嫁接6個(gè)月后調(diào)查各處理的嫁接成活率、新梢生長量、葉片形態(tài)、二叉枝和多叉枝分別占總枝量的比例。

嫁接成活率=成活的枝條數(shù)量/總的枝條數(shù)量×100%

(1)

二叉枝和多叉枝占總枝量的比例=二叉枝和多叉枝的數(shù)量/總的枝條數(shù)量×100%

(2)。

利用SPAD-502DL Plus葉綠素含量測定儀(日本Konica Minolta公司)測定葉片相對葉綠素(soil and plant analyzer development，SPAD)含量。

1.2.2 感病葉片病菌鑒定 采用組織分離法[24]。分別用刀切取2種梨葉片病健交界處組織，經(jīng)表面消毒(75%乙醇、1%次氯酸鈉)處理，從葉片上分離得到2種菌落形態(tài)的疑似真菌病原物。采用CTAB法分別提取菌絲DNA[25]，以DNA為模板，利用ITS1和ITS4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠DNA純化、測序公司測序，最終獲得ITS序列。利用NCBI BLAST對2個(gè)菌株的ITS序列進(jìn)行比對分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis，PLSS-DA)采用SIMCA-P軟件(V11.0, Umetrics, Ume?, Sweden)進(jìn)行計(jì)算和繪制。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，所有圖片通過Photoshop軟件進(jìn)行組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ輻射對梨接穗成活率的影響以及對葉片、枝條的生物損傷效應(yīng)

由表1可知，枝條嫁接成活率隨輻射劑量的增加而降低。與CK相比，50 Gy處理的翠冠和玉露香枝條接穗成活率最低，分別為66.67%和60.00%。表明輻射處理具有一定致死效應(yīng)，并隨著輻射劑量的增加，致死效應(yīng)越明顯。CK和20 Gy處理的翠冠梨枝條嫁接后二叉枝數(shù)均為0，30、40和50 Gy處理的二叉枝數(shù)占總枝數(shù)的比例分別為15.35%、19.47%、40.32%；CK、20和50 Gy處理的翠冠梨枝條嫁接后的三叉枝數(shù)均為0，30和40 Gy處理的二叉枝數(shù)占總枝數(shù)的比例分別為23.79%和9.73%。CK玉露香梨枝條嫁接后的二叉枝數(shù)量為0，20、30、40、50 Gy處理后的二叉枝數(shù)占總枝數(shù)的比例分別為3.97%、5.24%、7.76%、8.73%；CK、20、40和50 Gy處理玉露香梨枝條嫁接后的三叉枝數(shù)均為0，30 Gy處理玉露香梨枝條嫁接后的三叉枝數(shù)占總枝數(shù)的比例為1.51%。說明輻射處理導(dǎo)致梨枝條發(fā)生了變異，且不同輻射劑量及不同品種的生物損傷效應(yīng)存在差異。

由圖1、圖2可知，60Co-γ射線輻射使梨枝條和葉片形態(tài)出現(xiàn)畸形葉，如兩尖葉(圖1-B)、皺葉(圖1-C、D)、黃化葉(圖1-E)、半葉(圖1-F)、桃形葉(圖1-G～I(xiàn))等。部分正常枝分離為二叉枝(圖2-B)，甚至多叉枝(圖2-C)。

2.2 60Co-γ輻射處理梨葉片SPAD值的變化

通過對不同誘變處理的枝條長出的新葉片的SPAD值進(jìn)行主成分分析，在翠冠梨葉片SPAD值中，第1和第2主成分方差貢獻(xiàn)率分別為28.58%和16.50%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到45.08%。CK與不同輻射處理組翠冠梨沿著PCA1坐標(biāo)軸分開，表明誘變處理對翠冠梨產(chǎn)生了較明顯的變異效果(圖3-A)；在玉露香梨葉片SPAD值中，第1主成分、第2主成分方差貢獻(xiàn)率分別為33.12%和15.06%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到48.18%。玉露香梨CK與40 Gy處理沿著PCA1坐標(biāo)軸分開，與20 Gy處理沿著PCA2坐標(biāo)軸分開，而其他處理與CK堆積在一起，表明20 Gy和40 Gy處理對玉露香梨葉片影響較大(圖3-F)。

表1 輻射處理對枝條嫁接成活率以及枝梢形態(tài)的影響Table 1 Effects of radiation treatment on the survival rate and shoot shape of grafting shoots

注：A: 正常葉；B～I(xiàn): 畸形葉。Note: A: Normal leaf. B-I: Deformed leaf.圖1 輻照處理對新生葉片形態(tài)變化的影響Fig.1 Effects of radiation treatments on morphological changes of new leaves

注：A：正常枝；B：二叉枝；C：多叉枝。Note: A: Normal branch. B: Binary branch. C: Multi branch.圖2 輻射處理對新生枝條形態(tài)變化的影響Fig.2 Effects of radiation treatments on the morphological changes of new branches

為進(jìn)一步了解誘變處理對梨葉片葉綠素影響，將CK和不同輻射處理分別進(jìn)行偏最小二乘判別分析。在翠冠梨所有處理中，PLS1和PLS2總貢獻(xiàn)率達(dá)到了61.91%～77.16%，該貢獻(xiàn)率較高，可代表所有變異量，且CK和輻射處理組均沿著PLS1分開，進(jìn)一步說明輻射處理對翠冠梨影響較大(圖3-B、C、D、E)。在玉露香梨所有處理中，PLS1和PLS2總貢獻(xiàn)率達(dá)到70.98%～78.76%，該貢獻(xiàn)率較高，可代表所有變異量。其中CK與20和40 Gy 2個(gè)處理沿著PLS1分開，進(jìn)一步說明這2個(gè)處理對玉露香梨影響較大(圖3-G、H、I、J)。

2.3 梨葉片病害樣品病原菌分離鑒定

由圖4可知，經(jīng)過輻射處理的玉露香梨枝條的葉片病害較嚴(yán)重(枯死，病部有霉層)，而枝條無明顯病害癥狀(圖4-A、B)。為明確病害類型，對疑似病害樣品進(jìn)行菌株分離鑒定。通過組織分離法從染病葉片中分離到2種菌落形態(tài)的疑似真菌病原物，分別命名為JP-1與JP-2。JP-1與JP-2的菌落早期形態(tài)類似，菌絲生長較快，菌落呈白色，氣生菌絲呈絨毛狀；2 d 后JP-2菌落中圈形成明顯的黑色孢子層，而JP-1菌落仍為白色的絨毛狀(圖4-C、D)。

利用NCBI Blast對2個(gè)菌株ITS序列比對分析，發(fā)現(xiàn)JP-1為炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides), JP-2為黑曲霉(Aspergillusniger)(圖5)。結(jié)合ITS結(jié)果與葉片典型癥狀，確定該病原菌是炭疽病引起的，而黑曲霉為樣品中的腐生菌，非致病菌，說明誘變會(huì)誘發(fā)一些致病因子導(dǎo)致玉露香梨葉片感染炭疽病。

注：A、B：病害葉片；C： JP-1；D：JP-2。Note: A、B: Disease leaf. C: JP-1. D: JP-2.圖4 玉露香梨葉片病害樣品形態(tài)以及病原菌分離Fig.4 Isolation and identification of pathogens from pear leaf diseases treated

3 討論

肖鑫麗等[26]研究表明在不同果樹種類、品種和不同研究條件下進(jìn)行輻射誘變，輻射效果存在差異。大量研究表明，果樹中的香蕉[27]、蘋果[28-29]、梨[30]、獼猴桃[31]、龍眼[32]，蔬菜中的生姜[33]、黃瓜[34]、番茄[35]、莧菜[36]，花卉中的冬鳳蘭[37]、蝴蝶蘭[38]、紫薇[39]和黃牡丹[40]，草本植物中的鈍葉酸模[41]等植株成活率均隨著輻射劑量的增加而降低。輻射誘變引起植株性狀改變的原因主要有：一是，輻射誘變引起染色體畸變、堿基替換等遺傳物質(zhì)的突變；二是，RNA、蛋白質(zhì)的生物合成受到抑制，生長素及酶等生理活性物質(zhì)的代謝受到破壞，進(jìn)而影響個(gè)體表型；三是，輻照導(dǎo)致植物體內(nèi)某些基因處于“打開”或者“關(guān)閉”的狀態(tài)，進(jìn)而影響該基因的活躍程度及強(qiáng)度[5, 42]。

本研究中，翠冠和玉露香梨休眠枝條成活率降低可能是因?yàn)?0Co-γ輻射誘導(dǎo)休眠枝上的芽突變，同時(shí)導(dǎo)致芽體的頂端分生組織受到破壞，從而影響了嫁接成活率。而玉露香梨葉片易受炭疽病病菌侵害，可能是由于60Co-γ射線輻射啟動(dòng)了玉露香梨葉片體內(nèi)的炭疽病致病相關(guān)基因，使該基因處于開啟狀態(tài)，表達(dá)強(qiáng)度加強(qiáng)，或者抑制了自身的炭疽病抗病相關(guān)基因，使該基因處于關(guān)閉狀態(tài)，表達(dá)強(qiáng)度減弱，從而表現(xiàn)出感染炭疽病的表觀性狀。

目前根據(jù)梨種質(zhì)資源的地域、品質(zhì)特性以及遺傳特點(diǎn)，將其栽培品種分為五大類，即白梨、砂梨、秋子梨、新疆梨和西洋梨[43]。翠冠屬于砂梨類[44]，而玉露香梨屬于白梨類[45]。本研究所有輻射處理均對翠冠梨產(chǎn)生了較大的影響，而20和40 Gy 2個(gè)處理對玉露香梨影響較大。這可能是由于2種梨栽培區(qū)域、遺傳背景差距較大，導(dǎo)致其對輻射的響應(yīng)存在差異。閆海霞等[46]研究表明低劑量的60Co-γ輻射會(huì)使月季種子的發(fā)芽率提高，這可能由于輻射引起種子內(nèi)部生物自由基或有關(guān)酶活性變化，從而提高了種子新陳代謝，促進(jìn)了種子萌發(fā)。

半致死劑量通常被認(rèn)為是適宜的輻射劑量，更容易獲得有效的誘變效果[47]。如富士嫩枝和嘎啦蘋果休眠枝條60Co-γ輻射半致死劑量分別為30[28]和60 Gy[29]，碭山酥梨休眠枝條[14]和火龍果無菌苗[48]60Co-γ輻射半致死劑量均為40 Gy，獼猴桃枝條60Co-γ輻射半致死劑量為50.6～71.7 Gy[31]。本研究中，最高劑量50 Gy處理翠冠和玉露香梨枝條致死率分別為33.33%、40.00%，說明在翠冠和玉露香梨枝條中半致死劑量應(yīng)該高于50 Gy，這與庫爾勒香梨輻射研究結(jié)果一致[49]。本研究僅提供了輻射當(dāng)代數(shù)據(jù)，且劑量選擇偏小，未達(dá)到半致死劑量，下一步研究將提高輻射劑量，進(jìn)一步分析輻射劑量對梨枝條的生物損傷效應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究通過60Co-γ射線輻射處理翠冠和玉露香梨枝條發(fā)現(xiàn)，枝條嫁接成活率隨輻射劑量的增加而降低，輻射處理導(dǎo)致梨枝條和葉片變異，且不同輻射劑量處理及不同品種響應(yīng)輻射變異的生物損傷效應(yīng)存在差異。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過誘變處理的玉露香梨葉片易受炭疽病病菌侵害，梨枝條物理誘變育種適宜的輻射劑量高于50 Gy。該研究結(jié)果為60Co-γ射線輻射誘變技術(shù)在梨上的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。