川硬皮腫腿蜂學(xué)習(xí)經(jīng)歷對花椒與虎天牛蟲糞揮發(fā)物的行為反應(yīng)測定

馬 琴，邵林娟，楊 樺*

(1.九龍縣林業(yè)和草原局，四川 九龍 616200，2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 四川省林業(yè)生態(tài)工程省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

川硬皮腫腿蜂(SclerodermasichuanensisXiao)屬膜翅目腫腿蜂科(Bethylidae)天牛腫腿蜂屬(Scleroderma)。由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森保實(shí)驗(yàn)室周祖基、曾垂慧教授發(fā)現(xiàn)于四川，中國林科院森保專家蕭剛?cè)嵯壬?995年鑒定為新種并命名[1]，是一種能防治杉綜天牛(CallidiumvillosulumF.)、粗鞘雙條杉天牛(SemanotussionansterGressitt)、雙條杉天牛(S.bifasciatusMotschulsky)、花椒虎天牛(ClytusvaliandusF)等鉆蛀性害蟲的寄生性天敵昆蟲[2]。目前和管氏腫腿蜂(SclerodermaguauiXiao et Wu)一起廣泛應(yīng)用于松墨天牛(MonochamusalternatusHope)、花椒虎天牛(ClytusvaliandusFairmaire)、青楊天牛(SaperdapopulneaL.)、雙條杉天牛等林業(yè)害蟲的生物防治。該蜂在自然界數(shù)量少，分布范圍窄，需要在室內(nèi)大量繁殖，才能對害蟲進(jìn)行有效的控制。

花椒虎天牛在四川花椒各產(chǎn)地皆有分布, 主要危害5年生以上花椒樹(ZanthoxylumbungeanumMaxim), 10年生以上椒樹危害率最高[6]。該蟲主要取食樹干基部韌皮部或多年生主側(cè)枝, 未見危害1～2年生嫩枝。被害株基干部常被多頭幼蟲共同危害, 當(dāng)其圍繞樹干韌皮部蛀食一圈后, 造成整株樹的枯死。越西縣花椒420萬株，遭受花椒虎天牛危害的危害率達(dá)56.35%，其中，每年被害致死的死亡率為13.92%[7]。僅在四川漢源縣每年因該蟲危害導(dǎo)致近8%的花椒樹死亡，且多是成年掛果樹，年經(jīng)濟(jì)損失300余萬元[8]。目前對于花椒虎天牛的防治主要以人工捕殺成蟲幼蟲、誘捕器捕殺、化學(xué)防治等物理與化學(xué)方法[9,10]。但是這些方法比較費(fèi)時費(fèi)力，污染環(huán)境，最終也無法有效控制花椒虎天牛的危害?；ń坊⑻炫Ｓ紫x期長, 若采用寄生蜂防治, 有利于天敵增殖, 可提高生防效果。因此，生物防治特別是運(yùn)用寄生蜂防治越來越引起人們的重視，其不僅克服了物理與化學(xué)防治方法的缺點(diǎn)，而且其目的在于控制害蟲種群數(shù)量，而不是對害蟲的徹底消滅，在維持生態(tài)平衡上具有重要意義。

本文采用Y型嗅覺儀和觸角電位儀研究羽化初期川硬皮腫腿蜂對花椒揮發(fā)物、花椒虎天牛蟲糞木屑混合物誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)效應(yīng)，比較有無學(xué)習(xí)經(jīng)歷的川硬皮腫腿蜂對不同花椒濃度揮發(fā)物的行為反應(yīng)，以探索利用學(xué)習(xí)行為提高川硬皮腫腿蜂防治花椒虎天牛效果的途徑。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源和材料

供試腫腿蜂為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用黃粉蟲(TenebriomolitonL.)蛹繁殖的川硬皮腫腿蜂雌成蜂，于腫腿蜂即將羽化時，挑選蜂量中等、蜂繭干凈無污染的繁蜂管置于25±1℃，相對濕度60%～70%的人工氣候箱中培養(yǎng)供試。

采集5年生以上的花椒樹的健康枝條和被花椒虎天牛為害枝條的天牛蟲糞木屑混合物，材料采用保鮮袋密封，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 味源收集

用采樣袋(Oven Bags，美國Reynolds公司)分別套住不同處理的健康花椒枝條(36 g)和天牛蟲糞木屑混合物(36 g)，在采樣袋兩對角插入Tanex-TA填充的玻璃管(吸附劑50 mg，60～80目；玻璃管外徑6 mm、長85 mm，美國Supleco公司)和活性碳空氣過濾管，并用Teflon管分別連接大氣采樣器(QC-1型大氣采樣儀, 北京勞動保護(hù)科學(xué)研究所)的進(jìn)、出氣口，以0.5 L·min-1的空氣流速，動態(tài)吸附采集6 h。然后，用5 mL重蒸乙醚(化學(xué)純，成都市科龍化工試劑廠)洗脫，N2吹送濃縮至2 mL，用于行為反應(yīng)測定。

1.3 川硬皮腫腿蜂對揮發(fā)性信息化合物的學(xué)習(xí)處理

將正己烷收集的健康枝條與蟲糞木屑混合物揮發(fā)成分設(shè)置5個濃度梯度：0.01 g·mL-1，0.1 g·mL-1，1 g·mL-1，10 g·mL-1，100 g·mL-1；共計(jì)10個處理。在25℃下，川硬皮腫腿蜂蛹期為20 d，在幼蟲結(jié)繭15 d后，挑選出一定數(shù)量結(jié)繭較佳的指形管，每個處理取10 μL混合溶液滴于2 cm×0.5 cm的濾紙條上，待溶液揮發(fā)后，將濾紙片置于指形管中用棉花封存，成蟲羽化后當(dāng)天取出。

1.4 觸角電位生理反應(yīng)測定

觸角電位測定采用荷蘭Syntech公司生產(chǎn)的觸角電位儀。測定前用解剖刀將川硬皮腫腿蜂觸角自柄節(jié)從頭部挑出；用Spectra 360導(dǎo)電膠將其固定在PR (Gain10×)電極上，氣味管與觸角相距1 cm。測定方法按照杜永均等[11]的方法進(jìn)行。用微量取樣器抽取10 μl溶液,均勻地滴在2 cm×0.5 cm的濾紙條上，放入10 cm長的樣品管中，樣品管末端連接氣體刺激控制裝置。待基線穩(wěn)定后給予刺激，每次刺激時間為0.5 s，刺激間隔為30 s，以保證觸角感受能夠完全恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)每處理測試觸角6根，每樣品平均刺激5次。以重蒸正己烷為對照，將每一樣品觀測值的平均數(shù)除以前后2次對照測定值的平均值即得EAG反應(yīng)相對值。

1.5 行為反應(yīng)檢測

采用“Y”型嗅覺儀測定川硬皮腫腿蜂行為反應(yīng)。“Y”型玻璃管長臂10 cm，短臂長5 cm，內(nèi)徑均為1 cm，兩臂夾角75°，交叉處由標(biāo)準(zhǔn)磨口制成，兩側(cè)臂分別用Teflon管與10 cm長的樣品管相連。一樣品管放置氣味源，另一樣品管設(shè)為空白。樣品管用Teflon管依次連接蒸餾水加濕瓶(300 mL)，填裝活性炭的空氣凈化瓶(500ml)，然后連接到大氣采樣器排氣口?？刂瓶諝饬?.1 L·min-1～0.2 L·min-1,測量時間為8：00～12：00，溫度為25±2℃。

生測時，吸取10μL溶液滴在濾紙條(2 cm×0.5 cm)上,待溶劑揮發(fā)后，將濾紙條分別置于一容量瓶中,作為信號源，另一容量瓶設(shè)為空白。將腫腿蜂由Y型管長臂管口引入(每次1頭)，爬過長臂管口2 cm后開始計(jì)時，寄生蜂在Y型管分叉處做出選擇，取向不同的側(cè)臂。每頭蜂觀察5 min，爬過側(cè)臂3 cm,且停留時間1 min以上記為對該氣味有選擇，否則記為無選擇。記錄每個有效選擇的時長以待比較。每處理隨機(jī)測定腫腿蜂30頭，每測5頭調(diào)換Y型管兩臂位置，以消除管臂位置對寄生蜂行為可能產(chǎn)生的影響，每個處理測量完成后更換嗅覺儀，用酒精徹底清洗Y型管和連接的Teflon管及容量瓶，自然晾干，Y型管和容量瓶在100℃下烘干24 h，以消除不同處理間氣味殘留的影響。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Excel 2007和Word 2007作圖。生測數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)比較差異顯著性[12]，采用Duncan’s多重分析法比較各處理間的差異。

2 分析與結(jié)果

2.1 不同學(xué)習(xí)經(jīng)歷的川硬皮腫腿蜂對各味源的行為反應(yīng)

2.1.1 花椒枝條處理的川蜂對花椒枝條揮發(fā)物行為反應(yīng)

羽化期經(jīng)歷花椒枝條揮發(fā)物的川硬皮腫腿蜂行為生測結(jié)果如圖1所示，羽化期經(jīng)歷味源A的川硬皮腫腿蜂對味源A有一定的趨向性。其中，羽化期經(jīng)歷10 g·mL-1的花椒枝條揮發(fā)物，花椒枝條對川硬皮腫腿蜂的引誘率顯著高于驅(qū)避率(p<0.05)。

無學(xué)習(xí)經(jīng)歷川蜂對花椒枝條揮發(fā)物的行為反應(yīng)見圖2?？ǚ綑z驗(yàn)表明，味源A1～A5對無學(xué)習(xí)經(jīng)歷蜂沒有明顯引誘作用。當(dāng)味源濃度增加。對無學(xué)習(xí)經(jīng)歷蜂驅(qū)避作用明顯增強(qiáng)。

2.1.2花椒虎天牛蟲糞木屑處理的川蜂對花椒枝條揮發(fā)物行為反應(yīng)

羽化期經(jīng)歷花椒虎天牛蟲糞木屑的川硬皮腫腿蜂行為生測結(jié)果如圖3所示，羽化期經(jīng)歷味源B的川硬皮腫腿蜂對味源B有一定的趨向性。其中，羽化期經(jīng)歷10 g·mL-1的花椒虎天牛蟲糞木屑，花椒虎天牛蟲糞木屑對川硬皮腫腿蜂的引誘率顯著高于驅(qū)避率(p<0.05)。

無學(xué)習(xí)經(jīng)歷川硬皮腫腿蜂對蟲糞木屑混合揮發(fā)物的行為反應(yīng)見圖4?？ǚ綑z驗(yàn)表明，味源B1～B5對無學(xué)習(xí)經(jīng)歷蜂沒有明顯引誘作用。當(dāng)味源濃度增加。對無學(xué)習(xí)經(jīng)歷蜂驅(qū)避作用明顯增強(qiáng)。

2.2 川硬皮腫腿蜂對不同濃度味源的行為反應(yīng)多重比較

從羽化期經(jīng)歷不同味源的川硬皮腫腿蜂對不同濃度味源的行為反應(yīng)多重比較可以看出(見表1)，羽化期經(jīng)歷10 g·mL-1花椒枝條揮發(fā)物的川硬皮腫腿蜂對味源的行為反應(yīng)率最高，達(dá)到66.67%，與其余9種處理間存在顯著差異(P<0.05)，其次是羽化期經(jīng)歷10 g·mL-1蟲糞木屑揮發(fā)物的腫腿蜂對味源的行為反應(yīng)率64.44%。而經(jīng)歷0.01 g·mL-1花椒枝條與蟲糞木屑揮發(fā)物的腫腿蜂反應(yīng)率最低。

圖1 羽化期經(jīng)歷味源A的川硬皮腫腿蜂對各味源濃度的行為反應(yīng)Fig. 1 Behavioral response of emergence period through the odor source A of scleroderma sichuanensis to different sources注：χ2檢驗(yàn)中的 “n.s”表示P>0.05，“*”表示P<0.05。下同。A氣味源為花椒枝條揮發(fā)物，A1～A5分別為不同濃度0.01 g·mL-1、0.1 g·mL-1、1 g·mL-1、10 g·mL-1、100 g·mL-1。

圖2 無學(xué)習(xí)經(jīng)歷蜂對味源A1～A5的行為反應(yīng)Fig. 2 Behavioral responses of Scleroderma sichuanensis without learning experience to source A1～A5

圖3 羽化期經(jīng)歷味源B的川硬皮腫腿蜂對各味源的行為反應(yīng)Fig. 3 Behavioral response of emergence period through the odor source B of scleroderma sichuanensis to different sources注：B氣味源為花椒虎天牛蟲糞木屑混合提取物，B1～B5分別為不同濃度0.01 g·mL-1、0.1 g·mL-1、1 g·mL-1、10 g·mL-1、100 g·mL-1。

表1不同經(jīng)歷的川硬皮腫腿蜂選擇率與電位值多重比較

Tab.1 ThedifferentexperiencesofsclerodermaSichuanensisselectionrateandEAGvaluemultiplecomparison

誘導(dǎo)源濃度選擇率電位比值羽化期經(jīng)歷枝條羽化期經(jīng)歷蟲糞0.01 g·mL-138.89±2.94e0.72±0.12b0.1 g·mL-142.22±4.84e0.86±0.19b1 g·mL-152.22±2.22d 0.89±0.12b10 g·mL-152.22±2.94d0.95±0.05b100 g·mL-155.56±1.11cd1.08±0.14ab0.01 g·mL-156.67±1.92bcd1.11±0.13ab0.1 g·mL-157.78±2.94bcd1.18±0.31ab1 g·mL-161.11±1.11abc1.19±0.23ab10 g·mL-164.44±2.22ab1.27±0.26ab100 g·mL-166.67±1.93a1.67±0.35a

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，具不同大寫字母的數(shù)據(jù)表示差異極顯著(P<0.01，Duncan’s比較)，具不同小寫字母的數(shù)據(jù)表示差異顯著(P<0.05，Duncan’s比較)

2.3 川硬皮腫腿蜂對不同濃度味源的EAG反應(yīng)

從羽化期經(jīng)歷不同味源的川硬皮腫腿蜂對不同濃度味源的EAG反應(yīng)多重比較可以看出(見表1)，羽化期經(jīng)歷10 g·mL-1花椒枝條揮發(fā)物的川硬皮腫腿蜂對味源的EAG反應(yīng)率最高，達(dá)到1.6737±0.3487，與其余9種處理間存在顯著差異(P<0.05)。而經(jīng)歷1 g·mL-1花椒枝條與蟲糞木屑揮發(fā)物、0.01 g·mL-1花椒枝條揮發(fā)物和10 g·mL-1花蟲糞木屑揮發(fā)物的腫腿蜂反應(yīng)率最低。

3 結(jié)論與討論

寄生蜂羽化后, 面對的常是復(fù)雜多變的環(huán)境,它們必須高效的利用各種信號, 盡快找到合適寄主, 以繁衍后代[13]。寄主植物源物質(zhì)是寄生蜂搜索過程中利用的一類主要信號, 其中由寄主昆蟲取食誘導(dǎo)的揮發(fā)物尤為重要[14,15]。實(shí)踐證明, 在影響寄生蜂尋找寄主的諸因素中化學(xué)因素起主導(dǎo)作用, 而這種化學(xué)因素又主要指利它素[16]。

圖4 無學(xué)習(xí)經(jīng)歷蜂對味源B的行為反應(yīng)Fig. 4 Behavioral responses of scleroderma Sichuanensis without learning experience to odor source B

實(shí)驗(yàn)可知，無處理蜂對A(花椒枝條揮發(fā)物)、B味源(花椒虎天牛蟲糞木屑混合提取物)，特別是高濃度的A、B味源有明顯趨避性。而在羽化期經(jīng)過對A、B味源學(xué)習(xí)處理蜂，對A、B味源有了明顯的趨向性，這說明，A、B味源確實(shí)對提高川蜂對花椒虎天牛的搜索寄生有一定的影響。其中，A味源對川蜂影響最顯著的為A4氣味源；B味源對川蜂影響最顯著的為B4氣味源。相比較無處理蜂分別對A、B氣味源行為反應(yīng)，經(jīng)A味源學(xué)習(xí)處理蜂對A味源的趨向性更為明顯，選擇率也更為顯著。

通過利用花椒枝條揮發(fā)氣味和花椒虎天牛蟲糞揮發(fā)物對川硬皮腫腿蜂的多次刺激，以及室內(nèi)觸角電位實(shí)驗(yàn)和Y型嗅覺儀的生測，證明通過用花椒枝條揮發(fā)物和花椒虎天牛蟲糞對川硬皮腫腿蜂的馴化和刺激，確實(shí)提高了川硬皮腫腿蜂在花椒樹上對花椒虎天牛的反應(yīng)行為和辨別能力，這種結(jié)果是由于川硬皮腫腿蜂在羽化過程中，適應(yīng)了花椒枝條揮發(fā)氣味和花椒虎天牛蟲糞氣味，對于這兩種氣味有更高的辨別能力，經(jīng)處理的川硬皮腫腿蜂對花椒虎天牛的搜索能力有顯著提高。至于花椒枝條揮發(fā)物成分以及川硬皮腫腿蜂的嗅覺感受機(jī)制，有待于進(jìn)一步的研究。