丹參酮ⅡA逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及其機(jī)制研究①

陳莎莎 李 均

(遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)中藥應(yīng)用與基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,珠海519000)

慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)患病率逐年增高,已成為全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題[1]。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial mesench-ymal transition，EMT)是CKD的一個(gè)重要特征，導(dǎo)致腎功能受損，并最終發(fā)展為終末期腎病[2]。而目前對(duì)CKD的治療效果仍不滿意。近年來，中醫(yī)藥對(duì)防治CKD方面具有良好的臨床療效。丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)是從丹參根中提取的脂溶性活性成分，具有抗氧化、清除自由基、降低血液黏度、促纖溶、改善血循環(huán)、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等作用[3,4]。但丹參酮ⅡA抗腎間質(zhì)化方面的作用目前仍不清楚，本實(shí)驗(yàn)研究丹參酮ⅡA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人源性腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)株由中山大學(xué)病理生理系惠贈(zèng)；丹參酮ⅡA購自上海愛立信生物科技有限公司；TGF-β1購自美國Peprotech公司；DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增試劑盒均購自大連TaKaRa公司；兔抗人Fibronectin、Bax、Bcl-2、Caspase-3，抗兔IgG H&L(DyLight?488)均購自英國Abcam公司；兔抗人E-Cadherin、Snail、GAPDH，抗兔IgG HRP二抗、抗兔IgG H&L(Alexa Flour?555)均購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)80%左右予以傳代。將傳代的HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組及丹參酮 Ⅱ A組；三組細(xì)胞貼壁后用無血清培養(yǎng)基同步化24 h，正常組不予特殊處理，模型組予以10 ng/ml的TGF-β1處理48 h；丹參酮 Ⅱ A組在10 ng/ml的TGF-β1基礎(chǔ)上加入最佳濃度丹參酮 Ⅱ A處理48 h。

1.2.2CCK-8法篩選丹參酮ⅡA藥物最佳濃度 將HK-2細(xì)胞按每孔1×104個(gè)/100 μl接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，予以無血清培養(yǎng)基同步化24 h，加入0、1、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L梯度濃度的丹參酮ⅡA，藥物作用48 h后每孔加入10 μl CCK8，在37℃孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值,以未加藥組為對(duì)照組，每組設(shè)置6個(gè)平行孔，重復(fù)3次，細(xì)胞增殖率(%)=實(shí)驗(yàn)組的OD值/對(duì)照組的OD值×100%。根據(jù)細(xì)胞增殖率篩選藥物最佳濃度。

1.2.3RT-qPCR檢測Fibronectin、E-cadherin、Snail mRNA的表達(dá)水平 三組細(xì)胞的總RNA提取后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件(37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃)，再用 SYBR Green 染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，90℃ 15 s。選擇GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，運(yùn)用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.4Western blot 檢測Fibronectin、E-cadherin、Snail蛋白表達(dá)水平 按總蛋白試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度；根據(jù)目的蛋白分子量配置相應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠，每孔上樣量均為 30 μg，恒壓電泳分離蛋白，采用半干法恒流將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入Fibronectin、E-cadherin、Snail及內(nèi)參GAPDH一抗(稀釋比均為1∶1 000)，4℃過夜。次日TBST洗膜后分別加入抗兔IgG HRP二抗(稀釋比均為1∶2 000)，37℃孵育1 h后TBST洗膜，用ECL發(fā)光并拍照。采用Image-Pro Plus6.0軟件對(duì)蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.2.5免疫熒光檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá) 將各組細(xì)胞爬片用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌，用0.3%Triton-X100室溫下作用15 min，PBS沖洗，用10%山羊血清室溫下封閉30 min，加入兔抗人Bax、Bcl-2及Caspase-3(稀釋比均為1∶100)4℃過夜，PBS沖洗，加入抗兔IgG H&L(DyLight?488)或(Alexa Flour?555)二抗(稀釋比均為1∶500)，室溫下孵育30 min，PBS沖洗，用含DAPI的液體封固劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照,采用Image-Pro Plus6.0軟件測量蛋白的IOD/Aera值行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GeneForward ReverseFibronectin5′-ATGCAACGATCAGGACACAAGGAC-3′5′-TGCCTCTCACACTTCCACTCTCC-3′E-cadherin5′-GCTCTTCCAGGAACCTCTGTGATG-3′5′-AAGCGATGGCGGCATTGTAGG-3′Snail5′-GGCTCCTTCGTCCTTCTCCTCTAC-3′5′-CCAGGCTGAGGTATTCCTTGTTGC-3′GAPDH5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′

2 結(jié)果

2.1丹參酮ⅡA藥物最佳濃度的篩選 HK2細(xì)胞在1、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L不同濃度丹參酮ⅡA作用48 h后，CCK-8結(jié)果顯示(圖1)，10 μmol/L及以上濃度明顯影響細(xì)胞活性(P<0.01)，5 μmol/L及以下濃度對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響。根據(jù)丹參酮ⅡA對(duì)HK-2細(xì)胞具有保護(hù)作用，故選擇5 μmol/L作為最佳濃度作用TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞。

2.2三組細(xì)胞形態(tài)的變化 光學(xué)顯微鏡觀察三組HK-2細(xì)胞形態(tài)的變化,正常組HK-2細(xì)胞呈鵝卵石樣致密排列，典型上皮樣細(xì)胞形態(tài)；模型組細(xì)胞形態(tài)呈典型長梭形，大小不一，與肌成纖維細(xì)胞相似；丹參酮ⅡA組長梭形細(xì)胞明顯減少，更接近正常組細(xì)胞形態(tài)(圖2)。

2.3三組細(xì)胞中Fibronectin、E-cadherin、Snail mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果 以GAPDH為內(nèi)參，采用RT-qPCR檢測三組細(xì)胞中Fibronectin、E-Cadherin及Snail mRNA相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示正常組、模型組及丹參酮ⅡA組Fibronectin mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.09±0.10、2.41±0.09及1.49±0.14；E-Cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.05±0.05、0.49±0.03及0.69±0.04；Snail mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為0.83±0.17、2.97±0.21及1.15±0.32。與正常組相比，模型組Fibronectin、Snail mRNA的相對(duì)表達(dá)增加，E-Cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)減少(P<0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA組Fibronectin、Snail mRNA的相對(duì)表達(dá)降低，E-Cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)升高(P<0.05)，見圖3。

圖1 CCK8法檢測丹參酮ⅡA對(duì)HK-2細(xì)胞活性Fig.1 Effect of TanshinoneⅡA on cytoactive of HK-2 cells was detected by CCK8Note: Compared with control group,**.P<0.01.

2.4三組細(xì)胞中Fibronectin、E-cadherin、Snail 蛋白表達(dá)結(jié)果 以GAPDH為內(nèi)參，Western blot檢測正常組、模型組及丹參酮ⅡA組Fibronectin、E-cadherin、Snail相對(duì)表達(dá)水平分別為0.23±0.03、0.61±0.02及0.31±0.03；0.47±0.02、0.25±0.03及0.40±0.03；0.14±0.03、0.60±0.01及0.49±0.02。 與正常組相比， 模型組Fibronectin、Snail 蛋白表達(dá)增加，E-Cadherin 蛋白表達(dá)減少(P<0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA組Fibronectin、Snail 蛋白表達(dá)降低，E-Cadherin 蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖3。

圖4 Western blot檢測三組細(xì)胞Fibronectin、E-cadherin、Snail 蛋白表達(dá)Fig.4 Protein relative levels of Fibronectin,E-cadherin and Snail in three groups were detected by Western blotNote: *.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 免疫熒光檢測三組細(xì)胞中Bax的表達(dá)

Fig.5 Expressions of Bax in three groups were detected by immunofluorescence and calculated

Note: *.P<0.05,**.P<0.01.

圖6 免疫熒光檢測三組細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)

Fig.6 Expressions of Bcl-2 in three groups were detected by immunofluorescence and calculated

Note: *.P<0.05,**.P<0.01.

圖7 免疫熒光檢測三組細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)

Fig.7 Expressions of Caspase-3 in three groups were detected by immunofluorescence and calculated

Note: **.P<0.01.

2.5三組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 的表達(dá)結(jié)果 采用免疫熒光檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3。與正常組相比，模型組中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達(dá)明顯增加(P<0.01)，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA組Bax、Caspase-3的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而Bcl-2的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見圖5～7。

3 討論

腎小管上皮細(xì)胞EMT參與腎損傷后的病理性修復(fù)，與腎纖維化進(jìn)展為CKD有關(guān)[5]。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去上皮極性及細(xì)胞間鏈接，細(xì)胞發(fā)生骨架重組，細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力發(fā)生變化并可受多種信號(hào)通路調(diào)控，如上皮標(biāo)志物E-Cadherin等發(fā)生下調(diào)及間質(zhì)標(biāo)志物Fibronectin、Snail等出現(xiàn)上調(diào)[6]。Strippoli等[7]發(fā)現(xiàn)EMT過程中Fibronectin和Snail 基因激活，而下調(diào)Snail、Fibronectin的表達(dá)及上升E-Cadherin的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)EMT過程。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是導(dǎo)致CKD間質(zhì)纖維化的主要因素，也是腎小管上皮細(xì)胞EMT的公認(rèn)誘導(dǎo)因子[8]。TGF-β1可降低E-Caherin的表達(dá)，促進(jìn)Fibronectin、Snail的轉(zhuǎn)錄與激活，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻黠@肌成纖維細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞，如細(xì)胞極性、肌動(dòng)蛋白微絲及致密體的改變，導(dǎo)致腎間質(zhì)轉(zhuǎn)分化[9]。Strutz等[10]用TGF-β1處理小鼠腎小管上皮NP1細(xì)胞48 h后發(fā)現(xiàn)E-Cadherin的表達(dá)降低，致密連接體產(chǎn)生的相關(guān)蛋白ZO-1減少及細(xì)胞極性的喪失。Zivotic等[11]使用TGF-β1處理腎小管上皮細(xì)胞HK-2 48 h后發(fā)現(xiàn)HK-2細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，伴隨編碼E-Cadherin的CDH1的減少及間質(zhì)標(biāo)記物Snail轉(zhuǎn)錄增加。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M與正常組相比，細(xì)胞極性發(fā)生改變，成長梭形；上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-Cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)均下降(P<0.01)，而間質(zhì)標(biāo)記物Fibronectin、Snail mRNA和蛋白表達(dá)均上升(P<0.01)，表明TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化過程，細(xì)胞造模成功。為了保證丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞活性不受影響，我們通過CCK8法篩選出丹參酮ⅡA的最佳濃度為5 μmol/L，此濃度處理的丹參酮ⅡA組與模型組相比，長梭形細(xì)胞明顯減少，E-Cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)均增加(P<0.01)，F(xiàn)ibronectin、Snail mRNA和蛋白表達(dá)均減少 (P<0.01)，以上結(jié)果表明丹參酮ⅡA可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程。

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是腎間質(zhì)轉(zhuǎn)分化發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素[4,12,13]。Xu等[4]在缺血/再灌注的腎損傷(Ischemia/reperfusion induced renal injury，I/RIRI)模型大鼠中，丹參酮ⅡA預(yù)處理可通過下調(diào)Caspase-3等蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)來減弱腎臟炎性反應(yīng)，抑制凋亡，保護(hù)腎功能。楊紫依[14]等通過體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，建立缺氧/復(fù)氧模型模擬I/RIRI實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：丹參酮ⅡA可上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax以及Caspase-3表達(dá)，通過抑制凋亡減輕I/RIRI保護(hù)腎功能。而EMT過程在I/RIRI梗阻性腎病中起關(guān)鍵作用[13]。本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)模型組與正常組相比，Bax、Caspase-3的表達(dá)均增加(P<0.01)，Bcl-2的表達(dá)降低(P<0.01),表明TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生了凋亡。丹參酮ⅡA組與模型組相比，Bax、Caspase-3的表達(dá)均降低(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)升高(P<0.05),表明丹參酮ⅡA可通過抗細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。綜上所述，丹參酮ⅡA逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，其機(jī)制可能與抗細(xì)胞凋亡相關(guān)。